姜黃素對Aβ誘導的AD大鼠海馬CRMP－2表達的影響

尹紅蕾 李金鳳 喬立艷 曾志磊 王運良△ 劉亞君

1）解放軍第148中心醫院神經內科 淄博 255300 2）鄭州大學第二附屬醫院神經內科 鄭州 450014

軸突抑制因子［1］在阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的發生、發展中起著重要作用，塌陷反應介導蛋白－2（collapse response mediator protein 2，CRMP－2）能夠促進軸突生長［2］，磷酸化的 CRMP－2還參與了阿爾茨海默病中［3－4］神經突退行性變及神經纖維纏結的形成。我們構建Aβ誘導的認知障礙大鼠模型，觀察姜黃素對AD大鼠空間學習記憶能力及海馬內CRMP－2和磷酸化CRMP－2的影響，并對比軸突蛋白的生長變化，探討姜黃素治療阿爾茨海默病的機制。

1 材料和方法

1.1 試劑 主要試劑及儀器：Aβ1－40（美國Sigma公司），姜黃素（美國Sigma公司），小鼠抗Neurofilament 200抗體（武漢博士德生物工程有限公司），兔抗CRMP－2抗體和兔抗p－CRMP－2抗體（美國CST公司）。Morris水迷宮，腦立體定位儀（日本成茂公司），凝膠掃描成像儀（BIO－RAD公司），BS－50型光學顯微鏡（Olympus，German），圖像分析系統（北航CM－2000B型），RT－PCR反應試劑盒（TakaRa，大連寶生物公司）。

1.2 動物及分組 重慶醫科大學實驗動物中心提供健康雄性SD大鼠共53只，體質量230～250g。大鼠適應性喂養1周后，先進行Morris水迷宮測試，在4個象限測試中有2個象限超過2min未找到安全平臺者視為記憶障礙。淘汰后剩余的48只大鼠隨機分為3組：（1）空白對照組：海馬注射等容量的生理鹽水，腹腔注射與姜黃素等量的DMSO（n＝16）；（2）AD對照組：腹腔注射與姜黃素等量的DMSO（n＝16）；（3）姜黃素給藥組：腹腔注射溶解在DMSO的姜黃素（n＝16），1次／d，劑量300mg／kg，連續注射7d［5］。

1.3 制備β淀粉樣蛋白誘導的大鼠認知障礙模型 Aβ1－40用無菌生理鹽水稀釋成10μg／μL，37℃下孵育1周后變為聚集態Aβ。3.5%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后固定于立體定位儀上，按 “大鼠腦立體定位圖譜”［6］，選擇右側海馬CA1區為注射靶區，于前囟向后3.0mm，中線旁開2.2mm鉆開顱骨，微量進樣器自腦表面垂直進針2.8mm，將10μL Aβ1－40緩慢注入，留針10min以保證溶液充分彌散，然后緩慢撤針。空白對照組注入等體積生理鹽水。各組術后均單籠飼養至大鼠完全清醒。

1.4 Morris水迷宮行為學測試 動物模型制備1個月后，用Morris水迷宮法測定大鼠的學習記憶能力［7］。首先進行定位航行試驗 （place navigation）：歷時5d，2次／d，將大鼠面向池壁分別從2個入水點放入水中，記錄大鼠在2min內找到平臺的時間 （即逃避潛伏期，escape latency）和游泳路徑。如果在2min內大鼠未找到平臺，潛伏期記為120s，實驗者用木棒牽引大鼠至平臺上并停留10s后放回籠中。通過對訓練大鼠游泳尋找平臺，觀測其逃避潛伏期可檢測動物的學習能力。第6天撤除平臺，任選一個入水點將大鼠放入水中，進行空間探索試驗 （spatial probe），記錄2min內大鼠在池中的游泳軌跡和時間，分別計算在各象限停留時間的百分比。

1.5 標本取材 腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉后直接取腦（每組8只），置于冰面上的培養皿上，取右側海馬，分成兩份，放入用DEPC水浸泡過夜且已消毒的凍存管中，置于液氮中冷凍，2～3h后轉移－80℃冰箱中保存。剩余動物（每組各8只）心內灌注、固定、取材海馬部位，石蠟包埋，作石蠟切片（片厚4μm），行免疫組織化學檢查。

1.6 RT－PCR檢測海馬內 CRMP－2mRNA的表達 用Trizol一步法提取海馬組織總RNA。逆轉錄反應參數30℃10 min，50℃30min，99℃5min，5℃5min，瞬間離心。聚合酶鏈反應：40μL體系，以逆轉錄所得cDNA 10μL為模板，上游引物0.5μL、下游引物0.5μL。擴增參數為（94℃，2min）×1循環；（94℃30s，55～64℃30s，72℃36s）×35循環；72℃5min。結果用Quantity One－4.6.2軟件進行半定量分析，以目的基因的面積積分灰度值與β－actin基因區帶的面積積分灰度值之比表示目的基因的表達水平。

1.7 Western blotting 方 法 檢 測 海 馬 內 CRMP－2 和 p－CRMP－2蛋白表達 按照提取試劑盒說明提取蛋白，上樣進行變性不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）后移至PVDF膜上，將PVDF膜浸泡在含5%脫脂奶粉的封閉液中沖洗；將封閉后的PVDF膜在室溫下與兔抗CRMP－2抗體（1∶300）和兔抗p－CRMP－2抗體（1∶300）孵育1h，漂洗后加入辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG第二抗體（1∶5 000）室溫下孵育1h。加新配制的顯色液（Super ECL檢測液）顯色后晾干并照相保存。結果用Quantity One－4.6.2軟件進行分析，以目的蛋白的面積積分灰度值與β－actin蛋白區帶的面積積分灰度值之比表示目的蛋白的表達水平。

1.8 免疫組織化學方法檢測海馬內軸突蛋白表達 切片常規脫蠟至水，微波修復抗原，滴加小鼠抗Neurofilament 200抗體（1∶200），4℃孵育過夜；加二抗后，DAB顯色，然后脫水、透明、封片；PBS代替一抗作陰性對照；光學顯微鏡下觀察，棕黃色顆粒為免疫陽性細胞。

1.9 統計學分析 數據以均數±標準差（BZ_15_1694_320_1782_360）表示，采用SPSS 11.0統計軟件行單因素方差分析，檢驗水準α＝0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠行為學檢測 各組大鼠在Morris水迷宮定向航行試驗中的平均逃避潛伏期日漸縮短，表明通過學習訓練大鼠學習尋找平臺的能力得到了提高。從第2天開始，AD對照組與空白對照組對比發現平均逃避潛伏期明顯延長（P＜0.05，表1），大鼠軌跡圖多以邊緣式和隨機式為主，表明造模成功。如表2所示，撤去第Ⅱ象限中的平臺后，發現AD對照組在第Ⅱ象限的活動時間較其他2組明顯縮短（P＜0.05，表2），顯現出學習記憶力明顯減退。而姜黃素給藥組與空白對照組間對比發現大鼠學習、記憶能力無顯著差異（P＞0.05），表明姜黃素能夠顯著改善認知功能障礙大鼠的學習和記憶能力。

圖1 大鼠海馬區CRMP－2和p－CRMP－2蛋白的表達1：空白對照組；2：AD對照組；3：姜黃素對照組

2.2 姜黃素對 AD 大鼠海馬區 CRMP－2mRNA、CRMP－2蛋白和p－CRMP－2蛋白表達的影響 海馬內注射Aβ1－40后CRMP－2mRNA 的表達較 空 白 組 明顯降低 （P＜0.01），Western blotting結果顯示CRMP－2蛋白的表達也顯著降低，而姜黃素治療組CRMP－2mRNA和蛋白表達均升高，與AD模型組對比差異有統計學意義（P＜0.05）。Western blotting結果顯示海馬內注射 Aβ1－40后 p－CRMP－2蛋白的表達較空白組明顯升高（P＜0.05），而給予姜黃素治療后則顯著降低（P＜0.01），但仍高于空白對照組。見表3、圖1。

2.3 姜黃素對各組大鼠海馬區軸突蛋白表達的影響 空白對照組大鼠海馬區神經元形態正常，幾乎每個神經元都有軸突表達，而AD模型對照組大鼠海馬區域的神經元軸突表達明顯減少（P＜0.05），兩者光密度值分別為0.2135±0.0278和0.1146±0.0169。姜黃素給藥組與AD對照組比較顯示，前者軸突表達有所增加，光密度值為0.1741±0.0178，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

表1 各組大鼠逃避潛伏期變化 （BZ_15_1694_320_1782_360，s）

表2 大鼠在各象限停留時間的百分比 （BZ_15_1694_320_1782_360，%）

表3 各組大鼠海馬區CRMP－2mRNA、CRMP－2和p－CRMP－2蛋白情況 （BZ_15_1694_320_1782_360）

圖2 大鼠海馬軸突蛋白的表達（DAB×400）A：空白對照組；B：AD對照組；C：姜黃素治療組

2.4 p－CRMP－2蛋白表達與軸突生長情況的相關性分析p－CRMP－2蛋白表達與軸突的生長情況呈直線負相關（r＝－0.67308，P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠海馬區p－CRMP－2蛋白表達與軸突生長情況的相關散點圖

3 討論

姜黃素（curcumin）是從植物姜黃中提取的一種酚性色素，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等一系列作用，分子式為C21H20O6，安全低毒［8］。據報道，臨床及實驗室應用姜黃素迄今為止尚未發現明顯的不良反應，因而與非甾體抗炎藥［9］及其他抗氧化藥物相比，應用姜黃素已經成為治療AD安全、有效的新措施之一［10］。本研究中，Morris水迷宮顯示AD對照組較其他2組的空間學習記憶障礙更明顯，姜黃素治療組大鼠空間學習記憶能力雖低于空白對照組，但較AD對照組顯著提高，提示姜黃素對AD大鼠空間學習記憶能力有明顯改善作用，一定程度上可預防Aβ1－40導致的大鼠記憶和認知功能下降。已有研究證實姜黃素能夠有效地抑制Aβ的生成和聚集［11］，從而減輕 AD患者臨床癥狀［12］和病理改變［11］，但具體機制是否通過Rho－Rho激酶信號通路的下游信號分子CRMP－2，目前國內外尚無研究。

CRMP－2 在神經導向中發揮重要作用［2，13－14］，有研究發現［15］CRMP－2可通過促進微管合成來誘導軸突延伸，而CRMP－2磷酸化后則喪失了與微管蛋白異二聚體及微管蛋白結合并促進微管組裝的能力［16］，從而失去了促進軸突生長的作用。本實驗中，海馬內注射Aβ1－40后出現軸突再生障礙，可能與誘導了CRMP－2的磷酸化，從而使微管蛋白的動力學狀態發生改變，誘導生長錐塌陷，從而阻礙軸突再生有關。有研究者［17］在轉基因癡呆小鼠皮質中觀察到CRMP－2蛋白隨著小鼠年齡的增長而降低，這與我們觀察的結果相類似，我們發現磷酸化的CRMP－2蛋白表達與軸突蛋白表達呈負相關，也就是說p－CRMP－2蛋白不利于軸突蛋白的生長，這意味著Aβ1－40可導致腦內CRMP－2下降，并削弱CRMP－2對軸突生長的促進作用，我們也確實發現海馬內注射 Aβ1－40后 CRMP－2呈現下降趨勢，這與 Steven等［3］研究結果一致。

由于CRMP－2對神經元軸突的極化、延伸都起著非常重要的促進作用，它的降低可能會影響到癡呆后神經再生及神經修復的整個過程，導致認知功能障礙持續進展。此外，CRMP－2的磷酸化還能導致自身作用的失活，誘導生長錐塌陷，阻止軸突的再生。實驗中我們對AD大鼠用姜黃素進行干預后，CRMP－2在大鼠海馬內的表達顯著上調，同時軸突蛋白表達明顯增多，由此推斷姜黃素可能通過CRMP－2來發揮對軸突生長的促進作用。

本研究提示姜黃素可部分改善Aβ1－40誘導的AD模型大鼠空間學習記憶障礙，其機制可能與提高CRMP－2的表達并抑制CRMP－2的磷酸化從而促進軸突再生有關。基于我們對姜黃素治療AD動物模型的一系列研究，我們推測姜黃素是能夠治療AD且具有廣闊前景的較好藥物。

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