貯藏溫度與時間對櫸樹種子活力及抗氧化特性的影響

李鐵華 ，張 偉 ，文仕知 ，申 展 ，朱晉春 ，姚振一

(1.中南林業科技大學，湖南 長沙 410004；2.湖南環境生物職業技術學院，湖南 衡陽 421005)

貯藏溫度與時間對櫸樹種子活力及抗氧化特性的影響

李鐵華1，張 偉1，文仕知1，申 展1，朱晉春2，姚振一1

(1.中南林業科技大學，湖南 長沙 410004；2.湖南環境生物職業技術學院，湖南 衡陽 421005)

為了更好的探討櫸樹種子貯藏技術，分別用不同的貯藏溫度(3℃、10 ℃、常溫)和貯藏時間的櫸樹種子作研究對象，分別檢測了櫸樹種子的田間出苗率、超氧陰離子(O2-·)生成量、過氧化氫(H2O2)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性及過氧化物酶(POD)活性，結果表明：冰箱中3℃貯藏的櫸樹種子具有最高的田間出苗率，超氧陰離子(O2-·)生成量、過氧化氫( H2O2)含量最低，且超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性及過氧化物酶(POD)活性高，能及時迅速清除超氧陰離子(O2-·)、過氧化氫 (H2O2)及其它自由基，避免了它們對種子的傷害，種子的活力得以保持在較高水平，具有較高的田間出苗率，因此冰箱中3℃是櫸樹種子比較好的貯藏溫度。

櫸樹種子；活力；抗氧化特性；貯藏溫度；自由基

櫸樹Zelova schneideriana，屬榆科落葉喬木，分布于黃河流域以南的華中、華南及西南各省區；一般在海拔800 m以下。櫸樹是國家Ⅱ級保護植物，現存資源非常稀少，急需加強資源保護和加快繁殖。櫸樹材質堅硬，心材紫紅色，花紋美觀，是珍貴的硬闊葉用材樹種；另外，櫸樹樹形優美，葉色隨季節發生變化，近年來被許多地區開發為風景園林樹種[1]。

種子活力是一個考察種子品質和未來苗木生長潛能綜合狀況的指標。在貯藏過程中，許多植物的種子，其活力都表現出不同程度的下降，植物不同，種子的生理生化特性和生態學特性各異，因而種子的耐貯藏特性和活力變化情況表現出較大的差異，貯藏條件不同也將影響種子活力的變化。覃柳燕等發現，山豆根種子的活力隨著貯藏時間的延長逐漸下降，4 ℃更適合貯藏，可貯藏6個月，室溫貯藏在1個月之內[2]；易官美等研究認為，在室內盒藏、冰箱冷藏和茶園堆藏的條件下, 茶園堆藏具有較好的效果，茶樹的種子活力能夠較好地保持[3]。就林木種子來說，目前，只研究了少數幾個樹種種子的活力，研究的主要方面是關于林木種子活力的高低與種子質量的關系[4-5]，極少見珍稀樹種種子活力的研究報道，而對珍稀樹種種子活力變化及抗氧化特性及其相關影響因素的研究則更少。櫸樹母樹與種源稀缺，且結實有大小年現象，為了改進櫸樹種子的貯藏方法，更好地開發和利用這一珍貴的遺傳資源，研究其種子活力及抗氧化特性變化與貯藏條件的關系，具有重要的現實意義。

1 材料與方法

1.1 櫸樹種子

2009年10月在湖南省古丈縣采集了供試驗用的櫸樹種子。新鮮櫸樹種子采回后，薄層放置在通風蔭涼的地方，讓其自然干燥至含水量13%以下。然后取一部分種子進行發芽試驗，另一部分種子進行貯藏，貯藏時間分別為0、2、4、6、12和18個月。試驗所用種子的千粒重為16.7 g。

田間試驗過程中受環境及其它因素的影響比較大，采用8次重復試驗，其它所有試驗皆為重復3次。

1.2 種子貯藏

將自然干燥后的櫸樹種子分別以不同的方式進行貯藏：(1)實驗室常溫貯藏；(2)冰箱中10 ℃貯藏；(3)冰箱中3℃貯藏。

1.3 田間試驗

分別以不同貯藏溫度和不同貯藏時間的櫸樹種子，在盆栽土壤中進行點播，以盆栽土壤中的出苗率作為田間出苗率。

1.4 超氧陰離子(·)生成量

利用羅廣華[6]和Chaitanya[7]的方法進行測定。

1.5 過氧化氫(H2O2)含量

利用Brenan[8]和阮英[9]的方法進行測定。

1.6 超氧化物歧化酶(SOD)活性

使用鄒琦[10]的方法進行測定。

1.7 過氧化氫酶(CAT)活性

使用鄒琦[10]和Candan[11]的方法-紫外吸收法進行測定。

1.8 過氧化物酶(POD)活性的測定

使用 Nakano[12]和趙亞華[13]的方法進行測定。

2 結果與分析

2.1 貯藏溫度和時間對田間出苗率的影響

表1表明，貯藏2個月，3種貯藏溫度對櫸樹種子田間出苗率均沒有明顯的影響；超過2個月，3種貯藏溫度貯藏的櫸樹種子，隨著貯藏時間的延長，田間出苗率都逐漸下降，但下降的快慢程度不同；常溫貯藏的櫸樹種子，貯藏2個月后，田間出苗率就開始快速下降，而在冰箱10 ℃和冰箱3℃貯藏時，分別在櫸樹種子被貯藏4個月和6個月后，田間出苗率開始快速下降，比常溫貯藏的分別推遲2個月和4個月。同時，從表1還可以看出，不同的貯藏溫度貯藏的櫸樹種子，其田間出苗率隨貯藏時間的下降速度是不相同的，常溫貯藏的下降最快，冰箱10 ℃貯藏的次之，冰箱3℃貯藏的下降最慢，到貯藏的第18個月，櫸樹種子的田間出苗率分別下降了75.9%、63.2%和35.9%。

表1 貯藏溫度和時間與櫸樹種子田間出苗率Table 1Effects of storage temperatures and time on germination rate of Zelova schneideriana seeds in field

2.2 貯藏溫度和時間對超氧陰離子(·)生成量的影響

圖1貯藏溫度和時間與種子超氧陰離子生成量的關系Fig.1Relationship between storage temperature and times and the content of · in seeds of Zelova schneideriana

2.3 貯藏溫度和時間對過氧化氫(H2O2)含量的影響

圖2 顯示，隨著貯藏時間的延長，櫸樹種子過氧化氫(H2O2)含量逐漸增加，2個月后，過氧化氫(H2O2)含量上升速度加快，其中常溫貯藏的增加最快，冰箱10 ℃貯藏次之，冰箱3℃貯藏增加最慢。貯藏6個月后，不同溫度貯藏的櫸樹種子的過氧化氫(H2O2)含量存在顯著差異(P＜0.05)，貯藏18個月后，常溫貯藏的櫸樹種子的H2O2含量達到47.6 μmol/g，而冰箱3℃貯藏的櫸樹種子的H2O2含量為22.5 μmol/g，前者為后者的2.1倍。

圖2種子中過氧化氫(H2O2)含量隨貯藏時間的變化關系Fig.2Changing relationship between storage times andthe content of H2O2 in Zelova schneideriana seeds

2.4 貯藏溫度和時間對超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

圖3 顯示的是使用不同的貯藏溫度，櫸樹種子超氧化物歧化酶(SOD)活性隨著貯藏時間延長的變化情況，在最初2個月的貯藏中，櫸樹種子的SOD活性變化不大，僅略有升高，2個月后開始大幅上升，常溫貯藏和冰箱10 ℃貯藏的櫸樹種子的SOD活性都在貯藏的第4個月達到最高，分別為68.4和77.9 U/mg protein；冰箱3℃貯藏的櫸樹種子的SOD活性在貯藏的第6個月達到最高，103.7 U/mg protein，冰箱3℃貯藏的櫸樹種子的SOD活性最高，高活力持續的時間最長。隨后所有種子的SOD活性都開始下降。

圖3 貯藏溫度和時間與種子超氧化物歧化酶(SOD)活性的關系Fig.3Relationship between storage temperature and times and the activity of SOD in Zelova schneideriana

2.5 貯藏溫度和時間對過氧化氫酶(CAT)活性的影響

從圖4可以看出，3種貯藏溫度貯藏的櫸樹種子的過氧化氫酶活性都隨著貯藏時間的延長而逐漸增加，常溫和冰箱10 ℃在貯藏的第4個月、冰箱3℃在貯藏的第6個月，其過氧化氫酶活性分別達到最高，隨后開始下降；從0～4個月，冰箱3℃和10 ℃貯藏的櫸樹種子的過氧化氫酶活性幾乎相同，4～6個月后，冰箱3℃貯藏的櫸樹種子的過氧化氫酶活性繼續上升且在第6個月最高，達到16.5 U/mg protein。

圖4 貯藏溫度和時間與種子過氧化氫酶(CAT)活性的關系Fig. 4 Relationship between storage temperatures and time and the activity of CAT in Zelova schneideriana seeds

2.6 貯藏溫度和時間對過氧化物酶(POD)活性的影響

圖5 顯示，在0～4個月，隨著貯藏時間的延長，櫸樹種子的過氧化物酶(POD)活性逐漸升高，在貯藏的第4個月，過氧化物酶的活性達到最高，這時，冰箱3℃貯藏的櫸樹種子的過氧化物酶活性為15.62U/mg protein、冰箱10 ℃貯藏的為12.42U/mg protein、常溫貯藏的為10.37 U/mg protein，隨后都開始下降。從貯藏的第2個月起，冰箱3℃貯藏的櫸樹種子的過氧化物酶活性一直最高，冰箱10 ℃貯藏的次之，常溫貯藏的最低。

圖5 貯藏溫度和時間與種子過氧化物酶(POD)活性的關系Fig. 5 Relationship between storage temperature and times and the activity of POD in Zelova schneideriana

3 討 論

種子的田間出苗率反映的是種子的抗逆能力，是種子活力水平的具體表現。一般認為，種子發芽勢大的，其活力較高，田間出苗率也高，李培旺等研究了光皮樹等3個油料樹種，認為種子發芽勢與種子的活力指數相關密切，發芽勢高的，其活力指數也高[14]。表1顯示，常溫貯藏的櫸樹種子的田間出苗率下降快，表明活力水平下降快；冰箱3℃貯藏的櫸樹種子的田間出苗率下降慢，活力水平高；而冰箱10 ℃貯藏的櫸樹種子的活力水平介于兩者之間。

生物體內出現的自由基大多是·OH及其活性衍生物與超氧陰離子·，在生物體處于正常的情況下，自由基的產生與淬滅處于動態平衡狀態，使自由基處于較低的水平，這種平衡一旦被打破和破壞，自由基就會逐漸積累，當積累的量達到一定程度，就會對細胞和組織產生傷害，從而加快生物體衰老的速度和進程[15]。李顏與王倩研究了人工老化后的大蔥種子，老化后低活力種子的自由基含量迅速增加，老化1天自由基含量增加了70%，而老化6天增加高達191%[16]。本研究中（見圖1），到貯藏的第18個月，常溫貯藏的櫸樹種子的超氧陰離子(生成量遠高于冰箱 3℃貯藏的，前者是后者的2.9倍，導致了常溫貯藏的櫸樹種子受到傷害而迅速衰老，活力下降。

植物在衰老過程中，由于體內活性氧代謝平衡被破壞而使H2O2發生累積。H2O2是一種強氧化劑，可以使細胞內的核酸、蛋白質等生物大分子直接或間接地被氧化，也能使細胞膜及細胞器的膜系統遭受損害，從而導致和加速了組織與細胞的衰老、解體。本研究中，從櫸樹種子中H2O2的含量來看（見圖2），貯藏18個月后，常溫貯藏的櫸樹種子的 H2O2含量 (47.6 μmol·g-1)是冰箱3℃貯藏的 (22.5 μmol·g-1)2.1倍。冰箱 3℃貯藏的比常溫貯藏的低得多，種子本身受到H2O2的傷害相對較輕，種子活力高。

許多研究認為，SOD是應對氧自由基傷害的第一道防線，也是植物抗氧化作用的關鍵酶類。SOD的主要作用是在生物體內催化·形成H2O2。SOD的活性變化應從兩個方面來分析，一方面，生物體本身的衰老與外界的生理脅迫常導致體內大量產生·，·是SOD作用的底物，·的大量產生和積累會刺激和誘導SOD的合成并且會提高其活性，SOD活性的提高，能及時和高效地清除，使植物抗衰老和忍受不良環境的能力得到提高[17]；另一方面，當生物體衰老達到一定的程度，其SOD等酶的活性也開始下降[18]，而SOD等酶的活性下降，標志著生物體衰老已進行到一定的程度。在抗氧化系統中，SOD是與CAT協同作用的，SOD催化清除·所形成的產物H2O2正是CAT催化作用的底物[19]。綜合分析本研究的圖3和圖4可以看出，在貯藏的初始階段，SOD和CAT的活性都開始上升，且SOD與CAT的活性強度在變化趨勢上具有一定的一致性，表明了在貯藏的櫸樹種子中，SOD與CAT具有協同作用。在本研究中，常溫貯藏和冰箱10 ℃貯藏櫸樹種子在貯藏的第4個月開始，SOD與CAT的活性都快速下降，因而催化·和 H2O2分解的能力下降，導致了這兩種物質的大量增加和積累，造成了對種子的傷害，導致了種子活力下降；而冰箱3℃貯藏櫸樹種子的SOD與CAT的活性相對較高，且高活力持續的時間長，延緩了和 H2O2的增加和積累，減輕了它們的傷害，種子活力高。

POD活性大小，影響乙烯和木質素的合成，與植物清除氧自由基的能力有關，也與植物生長和衰老過程有關[20-21]。植物體內POD活性低，清除氧自由基的能力弱，反之，則清除氧自由基的能力相對較強。梁海榮等報道，隨著小麥種子活力的下降,它的過氧化物酶( POD) 、過氧化氫酶（CAT） 等酶類的活性也隨之下降[22]；朱世楊等人研究發現，老化的花椰菜種子經GA3處理后活力得到提高，其過氧化物酶( POD)活性也得到相應的提高[23]。本研究表明(圖5)，3種不同貯藏溫度下，冰箱3℃貯藏的櫸樹種子的POD活性高，清除氧自由基的能力強，迅速而及時地清除了氧自由基，種子少受氧自由基的傷害，種子活力下降慢，活力相對較高。

4 結 論

(1)隨著貯藏時間的延長，櫸樹種子的田間出苗率逐漸下降，常溫貯藏的下降最快、冰箱10℃貯藏的次之、冰箱3℃貯藏的下降最慢，說明冰箱3℃貯藏的櫸樹種子的活力得到較好的保存，種子活力高。

(2)隨著貯藏時間的延長，常溫貯藏的櫸樹種子的超氧陰離子(·)生成量和過氧化氫 (H2O2)含量都較高，給種子本身造成了傷害，使種子活力下降，種子活力低；而冰箱3℃貯藏的櫸樹種子的超氧陰離子(·)生成量和過氧化氫(H2O2)含量都較低，給種子本身造成的傷害輕，種子活力下降慢，種子活力高。

(3)冰箱3℃貯藏的櫸樹種子的超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性及過氧化物酶(POD)活性都較高且高活性持續的時間長，及時迅速清除了超氧陰離子(O2-·)、過氧化氫(H2O2)及其它自由基，避免了它們對種子的傷害，種子的活力得以保持，種子的活力高。

[1] 繆勉之,張仲卿,方蔭才.湖南主要經濟樹種[M].長沙:湖南科學技術出版社,1982.

[2] 覃柳燕，唐美瓊，黃永才,等. 貯藏溫度及時間對山豆根種子活力的影響[J].中國種業，2011，(1):35-37.

[3] 易官美,徐祥美.不同貯藏方法對廬山茶樹種子活力影響的比較研究[J].種子,2011,(3):7-9.

[4] 唐先韋, 邢世巖,李士美，等.老化處理對喜樹種子活力的影響[J].山東林業科技, 2006,(5):20-21.

[5] 覃初賢,白景彰,黃賢帥.不同包裝貯藏對桑樹種子活力的影響[J].蠶業科學,2006,(3):407-410.

[6] 羅廣華,王愛國. 植物的超氧物自由基與羥胺反應的定量關系[J].植物生理學通訊,1990,(6):55-57.

[7] Chaitanya K K, Naithani S C. Role of superoxide lipid peroxidation and superoxide dismutase in membrane perturbation during loss of viability in seeds of Shorea robusta Faertn [J].New Phytologist, 1994,(126):623-627.

[8] Brennan T, Frenkel C. Involvement of hydrogen peroxide in the regulation of senescence in pear [J]. Plant Physiology,1997,(59):411-416.

[9] 阮 英,劉開朗,申 琳,等. 番茄果實成熟衰老過程中果肉和種子活性氧代謝的變化[J].園藝學報,2006,33(1):63-67.

[10] 鄒 琦.植物生理學實驗指導[M].北京:中國農業出版社，2001.

[11] Candan N, Tarhan L. Relationship among chlorophtll-carotenoid content, antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation levels by Mg2+deficiency in the Mentha pulegium leaves [J].Plant Physiology and Biochemistry, 2003,(41):35-40.

[12] Nakano Y, Asada K. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate specific peroxidase in spinach chloroplasts [J]. Plant and Cell Physiology,1981,(22): 867-880.

[13] 趙亞華,高向陽. 生物化學實驗技術教程[M].廣州:華南理工大學出版社,2000.

[14] 李培旺,李昌珠,蔣麗娟,等.3種木本油脂植物種子活力研究[J].經濟林研究, 2006,24(1):71-73.

[15] 黃元喬,黃元汛,宋高晴,等.活性氧自由基特性及對衰老過程的作用[J].生物化學,1995,(58):62-63.

[16] 李 顏,王 倩.大蔥種子人工老化與膜脂過氧化的研究[J].種子,2007,(3):27-30.

[17] Lee D H, Kim Y S, Lee C B, The inductive responses of the antioxidant enzymes by salt stress in the rice (Oryza sativa L.)[J]. Plant Physiol. ,2001,(158): 737-745.

[18] Srilaong V, Tatsumi Y. Changes in respiratory and antioxidative parameters in cucumber fruit (Cucumis sativus L.) stored under high and low oxygen concentrations [J]. Jpn. Soc. Hort. Sci.,2003,(72): 525-532.

[19] Arora A, Sairam R K, Srivastava G C. Oxidative stress and antioxidative system in plants [J]. Curr. Sci. ,2002,(82): 1227-1238.

[20] Starzynska A, Leja M, Mareczek A. Physiological changes in the antioxidant system of broccoli fl ower buds senescing during short-term storage, related to temperature and packaging [J].Plant Science, 2003,165: 1387-1395.

[21] Kondo S, Kittikorn M, Kanlayanarat S. Preharvest antioxidant activities of tropical fruit and the effect of low temperature storage on antioxidants and jasmonates [J]. Postharvest Biology and Technology,2005,36:309-318.

[22] 梁海榮,邢侗姬,周小梅.不同活力的小麥種子生理生化及其修復的研究[J].山西大學學報:自然科學版, 2010,33(2):286-290.

[23] 朱世楊,張小玲,羅天寬，等. GA3對老化花椰菜種子活力和幾種相關生理生化性狀的影響[J]. 植物生理學通訊,2010,46(2): 143-146.

Effects of storage temperature and time on antioxidant properties and vigor change of Zelkova schneideriana seed

LI Tie-hua1, ZHANG Wei1, WEN Shi-zhi1, SHEN Zhan1, ZHU Jin-chun2, YAO Zhen-yi1
(1.Central South University of Forestry &Technology, Changsha 410004, Hunan, China;2. Hunan Polytechnic of Environment and Biology, Hengyang 421005, Hunan, China)

In order to fi nd better method for preserving seeds ofZelova schneideriana, the seeds ofZelova schneiderianapresenved with different temperatures and different time, were used as test material. The germination rate in fi eld, the content of· and H2O2and the time activites of SOD and CAT and POD of the seeds ofZelova schneiderianawere evaluated. The results indicated that the seeds ofZelova schneiderianawhich were stored in refrigerator at 3℃ had the highest fi eld seedling emergence rates, the activites of SOD and CAT and POD, and had the lowest contents of· and H2O2; on other hand, the· and H2O2and other free radical can be eliminated quickly because of high activites of SOD and CAT and POD. So the injury to these seeds was decreased, and the vigor of the seeds ofZelova schneiderianawas kept on a high level.

Zelova schneiderianaseed; vigor; antioxidant properties; storage temperature, free radical

S718.43

A

1673-923X(2012)09-0001-05

2012-06-21

國家林業公益性行業專項基金項目（201004066）；中南林業科技大學人才引進資助項目(07Y013)

李鐵華（1964-），男，湖南衡東人，教授，博士，主要從事林木種苗生理生態及森林培育方面的研究；

E-mail：tiehuali2000@yahoo.com.cn

[本文編校:吳 毅]