變應(yīng)性鼻炎小鼠模型的建立與IL-4、IFN-γ水平檢測(cè)

崔魯佳 阮 巖李嬋娟 秦麗娜

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510000；2.中山大學(xué)，廣東 廣州 510275；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100020）

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）在耳鼻咽喉科是一種常見(jiàn)病，是由致敏原引起體內(nèi)變化而引起的鼻黏膜慢性炎癥反應(yīng)性疾病，主要的臨床表現(xiàn)有鼻塞、流鼻涕、鼻癢、打噴嚏，以及嗅覺(jué)功能障礙等,近年來(lái)隨著工業(yè)化程度的發(fā)展，生態(tài)環(huán)境的惡化，AR的患病率在全球有增長(zhǎng)的趨勢(shì)，據(jù)國(guó)外統(tǒng)計(jì)，其發(fā)病率為10%～40%。變應(yīng)性鼻炎已成為全球性健康問(wèn)題。目前已用于變應(yīng)性鼻炎造模的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類(lèi)繁多，所選動(dòng)物有豚鼠、大鼠、小鼠及新西蘭兔等。本實(shí)驗(yàn)使用卵清蛋白誘發(fā)C57小鼠建立變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型，對(duì)其癥狀學(xué)、病理生理學(xué)進(jìn)行觀察，并對(duì)IL-4、IFN-γ水平進(jìn)行檢測(cè)，為該病的臨床研究提供依據(jù)。

材料與方法

1.材料

(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：采用清潔級(jí)、8周齡雄性C57BL6系統(tǒng)小鼠，體重在16-20g左右，共24只，購(gòu)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。在空調(diào)動(dòng)物房飼養(yǎng)，自由飲水，恒溫恒濕的環(huán)境下，SPF級(jí)固體飼料，適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。24只小鼠隨機(jī)分為2組：實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組，每組12只。另有2只體重250-300g的SD大鼠（購(gòu)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），飼養(yǎng)條件相同，避免接觸過(guò)敏原，被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)(passivecutaneous anaphylaxis reaction，PCA)備用。

(2)主要試劑：致敏原為卵清蛋白(OVA)，購(gòu)自上海歐韋達(dá)儀器科技有限公司（日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn)）；佐劑為氫氧化鋁(上海化工試劑總廠)。IL-4、IFN-γ 的 ELISA試劑盒均購(gòu)置美國(guó)R&D公司。

2.AR模型的建立：

(1)致敏：實(shí)驗(yàn)組小鼠用OVA 10ug、AI(OH)2mg加入生理鹽水0.1ml比例制成混懸液，自第0天開(kāi)始腹腔注射，隔天1次，共7次。對(duì)照組用生理鹽水代替同法注射。

（2）激發(fā)：PCA試驗(yàn)成功后，以 OVA 1g：生理鹽水10ml溶液，用微量加樣器，每側(cè)鼻腔4ul激發(fā)，每1d激發(fā)1次，連續(xù)激發(fā)7次。對(duì)照組以生理鹽水代替卵白蛋白滴鼻。

3.觀察項(xiàng)目：

（1）癥狀學(xué)觀察：從造模第1天開(kāi)始觀察動(dòng)物行為、狀態(tài)、體征、攝食、飲水、大小便性狀、體溫、體質(zhì)量等，并在每次鼻腔致敏后，觀察記錄10min內(nèi)小鼠鼻清涕量、噴嚏及搔鼻次數(shù)，采用疊加法計(jì)算總分，總分大于5分為模型成功。

（2）PCA反應(yīng)實(shí)驗(yàn)：

在基礎(chǔ)致敏完成后第2天，從各組中隨機(jī)取4只小鼠，取眼底靜脈采血0.3ml，將血液離心，取血清40ul并用生理鹽水按1：4，1：16，1：64，1：256 的比例進(jìn)行稀釋?zhuān)溆玫?2只SD大鼠，背部毛剃掉，用紅色油筆在背部劃數(shù)個(gè)直徑為1.5cm的圓圈，間隔2cm，將不同濃度的血清各0.1ml在圓圈內(nèi)皮下注射，48h后，將伊文斯藍(lán)10mg，OVA2mg溶解于1ml生理鹽水中，并注射于大鼠的股靜脈里，半小時(shí)后處死大鼠，觀察背部皮膚，測(cè)量藍(lán)斑直徑，若注射血清部位出現(xiàn)藍(lán)斑，且直徑大于5mm判定為陽(yáng)性反應(yīng)。證明有OVA特異性抗體，造模成功。

（3）測(cè)定細(xì)胞因子 IL-4、IFN-r：

末次激發(fā)12h內(nèi)，腹腔注射水合氯醛麻醉，摘眼球取外周血，并于3000r/min離心收集血清。用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定細(xì)胞因子IL-4、IFN-r。具體操作步驟遵照ELISA測(cè)定說(shuō)明書(shū)，采用Mod-el550型酶標(biāo)儀檢測(cè)和數(shù)據(jù)采集。

（4）病理學(xué)觀察：

采血后，斷頸椎處死小鼠，小心取出取小鼠鼻中隔前中部粘膜，用4%多聚甲醛緩沖液固定、5%甲酸脫鈣，經(jīng)脫水包埋、切片、HE染色，高倍鏡下觀察肥大細(xì)胞、嗜酸性白細(xì)胞、嗜堿性白細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。

4.統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 16·0統(tǒng)計(jì)軟件包，分析研究實(shí)驗(yàn)前后動(dòng)物癥狀的變化及各項(xiàng)理化指標(biāo)，全部數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.癥狀評(píng)分：

實(shí)驗(yàn)組12只動(dòng)物在激發(fā)后，小鼠頻頻用前爪抓鼻端兩側(cè)，并伴有噴嚏聲，清水鼻涕較多，評(píng)分都大于5分，造模成功。對(duì)照組僅輕度抓鼻，且噴嚏少，無(wú)流涕，評(píng)分均小于5分，造模未成功。且對(duì)照組的抓鼻次數(shù)和噴嚏次數(shù)在激發(fā)后10分鐘內(nèi)顯著低于實(shí)驗(yàn)組的次數(shù)(P<0.01)。

2.PCA實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)

PCA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以實(shí)驗(yàn)組小鼠血清接種的SD大鼠背部均出現(xiàn)藍(lán)圈，直徑在4-7 mm，而對(duì)照組僅見(jiàn)紅斑或藍(lán)點(diǎn)，基本上無(wú)藍(lán)圈反應(yīng)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中IgE效價(jià)較高。

3.測(cè)定細(xì)胞因子 IL-4、IFN-r：

IL-4含量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別為（18.64±9.5）pg/ml、（8.26±4.50）pg/ml，IFN-r含量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別為（10.28±8.5）pg/ml、（4.63±6.8）pg/ml，實(shí)驗(yàn)組 IL-4 和 IFN-r含量與對(duì)照組之間有顯著性差異(P<0.01)，顯著高于對(duì)照組。

4.病理學(xué)結(jié)果

模型組鼻黏膜下組織間質(zhì)水腫，小血管擴(kuò)張，血管內(nèi)及組織固有層內(nèi)可見(jiàn)以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)照組動(dòng)物鼻黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整，排列均勻，黏膜下層未見(jiàn)組織間隙水腫和血管充血，僅見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

討論

本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射和滴鼻激發(fā)的方法，可較好地保證模型局限于變應(yīng)性鼻炎的表現(xiàn)。根據(jù)癥狀評(píng)分，PCA反應(yīng)陽(yáng)性以及病理學(xué)顯示以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，證明選用C57小鼠可以成功建立變態(tài)反應(yīng)模型，且相對(duì)于其他動(dòng)物，C57小鼠的費(fèi)用低，可以大大降低實(shí)驗(yàn)的費(fèi)用。

末次激發(fā)12h內(nèi)外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-4和INF-γ均高于正常對(duì)照組，說(shuō)明IL-4和INF-γ在AR炎癥發(fā)生中起重要作用，符合人類(lèi)變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病過(guò)程，但人類(lèi)變應(yīng)性鼻炎INF-γ存在時(shí)相性變化，所以本實(shí)驗(yàn)仍有不足之處，需進(jìn)一步改進(jìn)，但本實(shí)驗(yàn)造模方法仍是可行的。

[1] 張范英，韓德民，諸小儂，等.辣椒辣素治療試驗(yàn)性變應(yīng)性鼻炎的組織病理學(xué)及免疫組織化學(xué)研究 [J].中華耳鼻咽喉科，1999，34：2292231.

[2] Tanaka K，Okamoto Y，et al.Anasal Allergy Model Developed in the Guinea Pig by Application of 2， 4-Toluene Disoey-anate[J].Int Allergy Appl Immuno，l 1988，85(4)：392-397.

[3] 揚(yáng)瑞嘉，黃志純.變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型的建立及評(píng)價(jià) [J].國(guó)際耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2007，31（2）：87-89.