單分散性納米銀凝膠制備及其抗菌性能研究

范友華，陳澤君，申愛榮，馬 芳

(湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長沙 410004)

單分散性納米銀凝膠制備及其抗菌性能研究

范友華，陳澤君，申愛榮，馬 芳

(湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長沙 410004)

以聚乙烯吡咯烷酮(K30)為穩(wěn)定劑，硝酸銀為銀源，通過化學(xué)還原法，制備了單分散性穩(wěn)定存在的納米銀凝膠，并運(yùn)用透射電子顯微鏡(TEM) 、紫外可見吸收光譜(UV-Vis)等對(duì)納米銀凝膠及室溫下存放1年凝膠進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，納米銀凝膠在室溫下放置1年后仍能穩(wěn)定存在，納米銀顆粒無明顯團(tuán)聚，分散性好。以大腸桿菌為研究對(duì)象，納米銀凝膠原樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為31.25×10-6，而保存1年后納米銀凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于62.5×10-6時(shí), 有較好抑菌效果; 該原樣最低抗菌濃度(MIC)為31.25×10-6，而保存1年后納米銀凝膠的最低抗菌濃度為62.5×10-6，表明該納米銀凝膠具有較好的抗菌性能，且隨著保存時(shí)間延長，該納米銀凝膠的抗菌性能有所下降。

納米銀凝膠；單分散性；大腸桿菌；抗菌性能

在納米狀態(tài)下，銀的小尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)顯著加強(qiáng)，具有很強(qiáng)穿透力和抗菌活性。納米銀在安全性、抗菌性、持久性、耐熱性等方面具有優(yōu)勢(shì)，在生物醫(yī)藥、抗菌材料中得到廣泛的應(yīng)用[1-4]。目前，納米銀的制備方法一般采用物理方法和化學(xué)方法兩大類：物理方法[5-6]需要用到激光、電弧高頻感應(yīng)或電子束照射等方法，所制備納米銀純度高、粒徑可控，但技術(shù)復(fù)雜、設(shè)備要求高；化學(xué)方法[6-8]以還原銀離子而獲得納米銀，操作簡單、成本較低，但粒度不容易控制，易團(tuán)聚，產(chǎn)品質(zhì)量往往不穩(wěn)定。

本研究以聚乙烯吡咯烷酮為穩(wěn)定劑，通過化學(xué)還原法制備了單分散穩(wěn)定存在的納米銀凝膠，并考察了銀凝膠的在室溫下的穩(wěn)定性能。同時(shí)，以大腸桿菌為研究對(duì)象，對(duì)銀凝膠的抗菌性能進(jìn)行了探討。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

硝酸銀，乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮(K30)，蛋白胨，牛肉膏，氯化鈉，瓊脂，均為國產(chǎn)分析純。大腸桿菌(8099)，中國科學(xué)院微生物研究所提供。恒溫恒濕培養(yǎng)箱，潔凈工作臺(tái)(蘇州凈化)，智能滅菌鍋(上海申生)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津泰斯特)，冰箱(海爾)，電子天平(0.1 mg)，實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.2 納米銀凝膠的制備

將不同質(zhì)量濃度的硝酸銀乙二醇溶液逐滴加入到一定濃度的PVP的乙二醇溶液中，

50℃下反應(yīng)1 h，溶液變成暗紅色，即為納米銀凝膠。

1.3 抗菌性能研究

1.3.1 營養(yǎng)基的制備

營養(yǎng)基按QB/T 2591-2003中A2.3方法進(jìn)行。

1.3.2 大腸桿菌的培養(yǎng)

1.3.2.1 菌種活化

將菌種接種在新的斜面培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接3次，得到活化后大腸桿菌培養(yǎng)物。

1.3.2.2 菌懸液的制備

取大腸桿菌第3代至第8代的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面18～24 h新鮮培養(yǎng)物，用5.0 mL吸管吸取無菌水加入斜面試管內(nèi)，反復(fù)吹，洗下菌苔。將洗下的菌液移至另一試管中，用振蕩器混勻后，用無菌水稀釋至適宜濃度(約為105cfu/mL)。細(xì)菌繁殖體懸液應(yīng)保存在4℃冰箱內(nèi)備用且保存不宜超過4 h。

1.4 納米銀凝膠的表征

透射電鏡圖片利用日本日立公司產(chǎn)的H-600型透射電子顯微鏡觀察，將樣品在水溶液中稀釋超聲分散，滴在銅網(wǎng)上待水干燥后觀察；紫外可見近紅外光譜采用美國Perkin-Elmer 公司的Lamda 950 型紫外可見光譜儀測(cè)定，測(cè)定波長范圍為300～600 nm。抗菌性能按QB/T 2591-2003進(jìn)行。

1.5 抑菌環(huán)試驗(yàn)

用無菌鑷子取抑菌片貼放在染菌平板中央，每個(gè)平板貼放1片抑菌片，同時(shí)以在染菌平板中央貼放1片陰性對(duì)照樣片作為對(duì)照。貼放好后，用無菌鑷子輕壓樣片，使其緊貼于平板表面。蓋好平皿，置37℃恒溫箱，培養(yǎng)16～18 h 觀察結(jié)果。每個(gè)試樣進(jìn)行3個(gè)重復(fù)。用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)的直徑(包括貼片)并記錄。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 最小抑菌濃度(MIC)試驗(yàn)

(1)按1.3.2 的方法制備大腸桿菌菌懸液，并稀釋至約108cfu/mL。

(2)將抗(抑)菌溶液用蒸餾水做對(duì)倍系列稀釋成不同濃度的受試液，取各稀釋度受試液2.5 mL加入到含2.5 mL雙倍濃度營養(yǎng)肉湯的試管中。

(3)取0.1 mL 菌懸液接種于含抗(抑)菌劑的營養(yǎng)肉湯的試管中，作為試驗(yàn)組樣本。

(4)以同樣方法接種不含抗(抑)菌劑的營養(yǎng)肉湯的試管中，作為陽性對(duì)照組樣本。

(5)以未接種的不含抗(抑)菌劑的營養(yǎng)肉湯試管，作為陰性對(duì)照組樣本。由于試樣本身有顏色，因此，以沒有接種菌懸液的不同濃度的受試液作為對(duì)照。

(6)將試驗(yàn)組樣本、陽性對(duì)照組樣本及陰性對(duì)照組樣本放置37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。

(7)試驗(yàn)中應(yīng)將試驗(yàn)用菌懸液進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)，其作用濃度應(yīng)為5×105cfu/mL～5×106cfu/mL。

當(dāng)陽性對(duì)照管有細(xì)菌生長(混濁)，陰性對(duì)照管無菌生長(透明)，試驗(yàn)用菌懸液的作用濃度為5×105cfu/mL～5×106cfu/mL時(shí)，試驗(yàn)組無菌生長的最高稀釋度所對(duì)應(yīng)的抗(抑)菌劑濃度，為該樣品對(duì)受試菌的MIC。

2 結(jié)果與討論

2.1 透射電鏡(TEM)結(jié)果分析

納米銀凝膠的TEM照片為圖1。從圖1可以看出，納米銀顆粒在膠體中均勻分散，硝酸銀濃度不同時(shí)，納米銀顆粒粒徑也不同，納米銀粒徑隨著硝酸銀濃度的增大而增大。硝酸銀低濃度時(shí)，納米銀顆粒為3 nm左右(圖1-A)，逐漸增大到8 nm左右(圖1-B)。室溫下，凝膠密閉存放1年后透射電鏡照片見圖1-C，從圖中可以看出，納米銀顆粒分散均勻，粒徑為12 nm，納米銀顆粒未發(fā)生明顯團(tuán)聚，其原因是聚乙烯基吡咯烷酮中側(cè)鏈分子中的N上的孤電子對(duì)與銀之間的弱相互作用，穩(wěn)定了納米銀顆粒[9-12]。圖1-D為單納米銀晶的高倍透射電子顯微鏡照片，從圖中可知，納米銀以單晶形式存在。

圖1 納米銀凝膠的透射電鏡Fig. 1 TEM of silver nanogel

2.2 紫外-可見光譜分析

圖2為納米銀凝膠的紫外可見光譜圖。采用納米銀水溶液進(jìn)行分析時(shí)，吸收峰一般出現(xiàn)在380～450 nm[13-14]，且pH不同時(shí)，也會(huì)在700 nm左右出現(xiàn)強(qiáng)的吸收峰[13]。球形或近球形形貌的納米銀粒子的表面等離子體共振吸收在410 nm出現(xiàn)一吸收峰，圖2說明銀納米粒子為球形形貌(圖1也證實(shí)這一點(diǎn))。當(dāng)顆粒尺寸不均勻或具有其他形貌的結(jié)構(gòu)時(shí)，紫外可見光譜會(huì)發(fā)生紅移[14]。從圖2-C可以看出，納米銀凝膠存放1年后，在410 nm處只有一個(gè)強(qiáng)的吸收峰，與原納米銀凝膠具有相同的吸收?qǐng)D譜，說明凝膠中納米銀顆粒仍呈球形或近球形形貌分散于溶液中。

2.3 抗菌性能研究

2.3.1 抑菌環(huán)試驗(yàn)

根據(jù)抑菌作用評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，抑菌環(huán)直徑大于14 mm 者，則樣品具有抑菌作用，而抑菌環(huán)直徑小于或等于14 mm 者，則為無抑菌作用。從表1可以看出，原樣受試液中納米銀濃度大于31.25×10-6時(shí)，抑菌圈大于14 mm；濃度小于15.625×10-6時(shí)，其抑菌效果不明顯。保存1年后樣品受試液中納米銀濃度大于62.5×10-6時(shí)，抑菌圈大于14 mm；當(dāng)受試液中納米銀濃度小于31.25×10-6時(shí)，其抑菌效果不明顯。表明保存1年后的納米銀凝膠抑菌效果有所下降。

圖2 納米銀凝膠的紫外可見光譜(cm-1)Fig. 2 UV-Vis spectra of silver nanogel

表1 原樣和1年后樣品的抑菌環(huán)直徑Table 1 Inhibition zone diameters of original sample and one-year sample with different concentrations

2.3.2 最小抑菌濃度(MIC)結(jié)果

受試液長菌情況見表2。從表2可知，原樣試驗(yàn)樣品濃度≥31.25×10-6時(shí)，參照樣品接菌后培養(yǎng)48 h后試管內(nèi)液體依然澄清，而當(dāng)濃度≤(15.625×10-6)時(shí)，試管內(nèi)液體混濁。保存1年后樣品濃度≥(62.5×10-6)時(shí)，參照樣品接菌后培養(yǎng)48 h后試管內(nèi)液體依然澄清，而當(dāng)濃度≤(31.25×10-6)時(shí)，試管內(nèi)液體混濁。用無菌取樣器吸取0.1 mL培養(yǎng)48 h的培養(yǎng)物于伊紅美蘭平板上，用玻璃刮鏟涂勻后于37℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果來看。原樣試驗(yàn)樣品濃度≥(31.25×10-6)時(shí)，培養(yǎng)基上無細(xì)菌生長，而當(dāng)濃度≤(15.625×10-6)時(shí)，培養(yǎng)基上有細(xì)菌生長。保存1年后試驗(yàn)樣品濃度≥(62.5×10-6)時(shí)，培養(yǎng)基上無細(xì)菌生長，而當(dāng)濃度≤(31.25×10-6)時(shí)，培養(yǎng)基上有細(xì)菌生長。因此可知，原樣的MIC為(31.25×10-6)，而保存1年后樣品MIC為62.5 (62.5×10-6)，說明保存1年后，納米銀MIC有所下降。

表2 最小抑菌濃度Table 2 Minimum inhibitory concentrations (MIC)of different samples and original sample

3 結(jié) 論

以聚合物聚乙烯吡咯烷酮為穩(wěn)定劑，通過化學(xué)還原法，制備出單分散性納米銀凝膠，室溫放置一年后，納米銀凝膠未發(fā)生明顯團(tuán)聚。以大腸桿菌為研究對(duì)象，該納米銀凝膠樣品在大于31.25×10-6，而保存1年后納米銀凝膠濃度大于62.5×10-6時(shí)有較好抑菌效果，該原樣最低抗菌濃度(MIC)為31.25×10-6，而保存1年后納米銀凝膠的最低抗菌濃度為62.5×10-6，表明該納米銀凝膠具有較好的抗菌性能，保存1年后，該納米銀凝膠的抗菌性能有所下降。

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Study on preparation of monodispersity silver nanogel and its antimicrobial properties

FAN You-hua, CHEN Ze-jun, SHEN Ai-rong, MA Fang
(Hunan Forestry Academy, Changsha, 410004, Hunan, China)

Monodispersity silver nanogel was prepared via chemical reduction method using silver nitrate as silver source and Polyvinylpyrrolidone (PVP) as stabilizer. The silver nanogel and stored for one-year silver nanogel were characterized by transmission electron microscope, UV-Vis spectrum. The results reveal that the silver nanogel deposited for one-year under indoor temperature had good stability and good dispersibility, its silver grains had no envious agglomeration. Antibacterial nature tests were carried out with Escherichia coli. The results show that the silver nanogel had good antibacterial performance and the minimum inhibitory concentrations(MIC) of the original silver nanogel was 31.25×10-6, while the sample stored one- year, the MIC was 62.5×10-6. The results prove that the antibacterial performance of nanogel descend with the storing time eхtension.

silver nanogel; monodispersity; Escherichia coli; antimicrobial properties

S785

A

1673-923X(2012)02-0118-04

2011-09-28

湖南省林業(yè)科學(xué)院科研創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2010-13-04)；湖南省科技廳項(xiàng)目(2011SK3273)

范友華(1980—)，男，湖南隆回人，助理研究員，博士研究生，主要從事生物質(zhì)功能材料研究；E-mail：yh_fan@163.com

[本文編校:邱德勇]