食品安全級固定化載體－殼聚糖微球制備的條件

吳巧麗張少凡孫 洋錢 方

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.吉林省輕工業(yè)設(shè)計研究院，吉林 長春 130012；3.大連工業(yè)大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

食品安全級固定化載體－殼聚糖微球制備的條件

吳巧麗1張少凡2孫 洋3錢 方1

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.吉林省輕工業(yè)設(shè)計研究院，吉林 長春 130012；3.大連工業(yè)大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

研究殼聚糖固定化微球載體制備的最佳條件，為進(jìn)一步用食品安全級載體——殼聚糖固定化乳糖酶提供理論基礎(chǔ)。用凝聚／沉淀法制備殼聚糖微球載體。結(jié)果表明，20 g／L殼聚糖（1%冰乙酸溶液），以距凝結(jié)液面20～30 cm滴入終濃度20%NaOH和30%甲醇的凝結(jié)液中，液滴剛滴入時不攪拌。該條件下制得直徑為（4.00±0.06）mm，平均重量（30.80±0.02）mg／個，每個殼聚糖載體的比表面積為4.08×10－4m2／g，形狀完整，大小均一，具有彈性。

殼聚糖；微球載體；固定化

殼聚糖是甲殼質(zhì)脫乙酰化的衍生物。是目前發(fā)現(xiàn)的唯一的一種天然的堿性多糖，其在材料工業(yè)、化妝品、紡織、印染、造紙、生物醫(yī)藥、環(huán)保、農(nóng)業(yè)等多方面具有廣泛用途［1，2］。殼聚糖分子中存在氨基，不溶于水、堿和有機(jī)溶劑，但溶于稀有機(jī)酸及鹽酸等部分無機(jī)酸。其來源豐富，成本低廉，機(jī)械性能好，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，且生物相容性好，易生物降解，對酶無毒，易于成型，使固定化酶的外型能滿足生化反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)要求，是一種具有良好開發(fā)利用前景的固定化酶載體［3］。國外利用殼聚糖作載體，固定化了堿性蛋白酶、過氧化氫酶、葡萄糖苷酶等［4－6］。中國相關(guān)固定化的有纖維素酶、脲酶、半纖維素酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶等［7－11］。本試驗以殼聚糖為研究對象，探尋制備殼聚糖微球載體的最佳條件，為進(jìn)一步研究用食品安全級載體－殼聚糖固定化乳糖酶提供理論依據(jù)。

1 材料與設(shè)備

1.1 試劑

殼聚糖（脫乙酰度≥90%）：食品級，大連鑫蝶甲殼素有限公司；

氫氧化鈉、冰乙酸、甲醇、甲醛等：均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

精密p H計：PHS－3C型，上海雷磁儀器廠；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG－9070A型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DK－S22型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 殼聚糖載體評價 根據(jù)殼聚糖的溶解情況、溶液狀態(tài)，滴入凝結(jié)液中的成膜狀況，制得微球的形狀、大小等諸方面進(jìn)行評價。

1.3.2 凝結(jié)液組成的確定 20 g／L殼聚糖（1%冰乙酸），分別滴入終濃度20%NaOH和30%甲醇、20%NaOH和30%甲醛的凝結(jié)液中，觀察微球載體性狀以確定凝結(jié)液的組成。

（1）NaOH 濃度的確定：20 g／L殼聚糖（1%冰乙酸），分別滴入終濃度30%甲醇和5%，10%，15%，20%NaOH的凝結(jié)液中，觀察微球載體性狀以確定凝結(jié)液中NaOH的濃度。

（2）甲醇濃度的確定：20 g／L殼聚糖（1%冰乙酸），分別滴入終濃度20%NaOH和5%，10%，15%，20%甲醇的凝結(jié)液中，觀察微球載體性狀以確定凝結(jié)液中甲醇的濃度。

1.3.3 殼聚糖濃度的確定 0.10 g殼聚糖分別溶于2.5，5.0，10.0，20.0 m L 1% 冰 乙 酸 溶 液 中，制 得 5，10，20，40 g／L殼聚糖溶液，滴入終濃度20%NaOH和30%甲醇的凝結(jié)液中，觀察微球載體性狀以確定殼聚糖的濃度。

1.3.4 冰乙酸濃度的確定 0.10 g殼聚糖，分別溶于5 m L 1%，5%，10%，15%，20%冰乙酸溶液中，滴入終濃度20%NaOH和30%甲醇的凝結(jié)液中，觀察微球載體性狀以確定冰乙酸的濃度。

1.3.5 液滴滴入高度的確定 20 g／L殼聚糖（1%冰乙酸）溶液，分別在距離凝結(jié)液液面＜10 cm，20～30 cm，＞30 cm的高度滴入終濃度20%NaOH和30%甲醇的凝結(jié)液中，觀察微球載體性狀以確定滴液高度。

1.3.6 攪拌的影響 20 g／L殼聚糖（1%冰乙酸），滴入終濃度20%NaOH和30%甲醇的凝結(jié)液中，分別在滴入凝結(jié)液中時進(jìn)行攪拌和不攪拌操作，觀察微球載體性狀，以確定有無攪拌對微球載體性狀的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝結(jié)液的組成確定

殼聚糖是甲殼質(zhì)脫乙酰化的產(chǎn)物，具有很多游離氨基。不溶于水、堿和有機(jī)溶劑，但溶于稀有機(jī)酸及鹽酸等部分無機(jī)酸。為提高殼聚糖固定化乳糖酶的效果，本試驗對殼聚糖微球載體的制備進(jìn)行系統(tǒng)研究。

由于殼聚糖分子結(jié)構(gòu)存在大量氨基，具酸溶、堿及有機(jī)溶劑沉淀的特性，本試驗研究了不同凝結(jié)液對殼聚糖微球載體性狀的影響，將殼聚糖（1%冰乙酸）溶液滴入不同組成的凝結(jié)液中，制得微球載體的性狀見表1。

表1 凝結(jié)液組成對殼聚糖載體性狀的影響Table 1 Affection of concretion liquid composition on character of chitosan support

由表1可知，凝結(jié)液20%NaOH與30%甲醇之組合，所制得的殼聚糖微球載體有彈性，不易破碎，可以長期使用。而20%NaOH與30%甲醇組合，其制得的殼聚糖微球載體則質(zhì)軟且易破碎。因此確定凝結(jié)液由NaOH和甲醇組成。

2.2 NaOH濃度的確定

為了研究凝結(jié)液中不同NaOH濃度對殼聚糖微球載體性狀的影響，將殼聚糖（冰乙酸）溶液滴入由同一濃度的甲醇和不同濃度NaOH組成的凝結(jié)液中，制得微球載體的性狀見表2。

表2 NaOH濃度對殼聚糖載體性狀的影響Table 2 Affection of NaOH concentration on character of chitosan support

由表2可知，凝結(jié)液中NaOH濃度為0%時，殼聚糖液滴不能形成固化膜且不能在凝結(jié)液中形成微球，隨著NaOH含量的增加，所形成微球的性狀更加穩(wěn)定，且具有一定的彈性。因此，確定凝結(jié)液中NaOH濃度為20%。

2.3 甲醇濃度的確定

為了研究凝結(jié)液中不同甲醇濃度對殼聚糖微球載體性狀的影響，將殼聚糖（冰乙酸）溶液滴入由同一濃度NaOH和不同濃度甲醇組成的凝結(jié)液中，制得微球載體的性狀見表3。

表3 甲醇濃度對殼聚糖載體性狀的影響Table 3 Affection of methanol concentration on character of chitosan support

由表3可知，凝結(jié)液中甲醇濃度低于10%時，不能在液滴內(nèi)外形成足夠壓力差使殼聚糖液滴收縮，制得的殼聚糖微球載體質(zhì)軟易碎；濃度高于20%時，能形成大量的殼聚糖微球；達(dá)到30%時，制得的微球載體形狀完整，大小均一。綜上可確定凝結(jié)液組成為終濃度的20%NaOH和30%甲醇。

2.4 殼聚糖濃度的確定

為了研究殼聚糖濃度對微球載體性狀的影響，將不同濃度的殼聚糖（冰乙酸）溶液滴入凝結(jié)液中，制得微球載體的性狀見表4。

由表4可知，殼聚糖濃度低于5 g／L時，瞬間沉淀的殼聚糖分子較少，不足以聯(lián)成固化膜或交聯(lián)網(wǎng)，故不能成球；而濃度高于40 g／L時，溶液黏度大，不易操作。因此確定殼聚糖濃度為20 g／L。

表4 殼聚糖濃度對殼聚糖微球載體性狀的影響Table 4 Affection of chitosan concentration on character of chitosan support

2.5 冰乙酸濃度的確定

為了研究冰乙酸濃度對殼聚糖載體性狀的影響，用不同濃度的冰乙酸配制殼聚糖溶液，滴入凝結(jié)液中制得微球載體的性狀見表5。

表5 冰乙酸濃度對殼聚糖載體性狀的影響Table 5 Affection of acetic acid concentration on character of chitosan support

由表5可知，隨著冰乙酸濃度的增大，溶解現(xiàn)象逐漸增大，不能形成固化膜、制成中空微球。因此，確定用1%的冰乙酸溶液配制殼聚糖溶液。

2.6 滴入液滴高度的確定

為了研究殼聚糖溶液的滴入高度對微球載體性狀的影響，以距離凝結(jié)液面不同的高度將殼聚糖溶液滴入凝結(jié)液中，制得微球載體的性狀見表6。

表6 滴液高度對殼聚糖載體性狀的影響Table 6 Affection of drip height on character of chitosan support

將20 g／L殼聚糖（1%冰乙酸）溶液滴入凝結(jié)液中，滴液的高度直接影響球形殼聚糖微球載體的大小。當(dāng)距液面高度低于10 cm或高于30 cm時，微球所受液面的壓力過大，制得微球載體呈現(xiàn)扁圓形。因此，以距離液面高度20～30 cm為宜。

2.7 攪拌的影響

為了研究攪拌情況對殼聚糖載體性狀的影響，將殼聚糖溶液滴入凝結(jié)液時有攪拌時，所形成的固化膜變形，產(chǎn)品形狀不完整；而沒有攪拌時，能形成狀態(tài)良好的球形固化膜，產(chǎn)品形狀完整。

殼聚糖微球載體在制備過程中，若有攪拌，可能導(dǎo)致部分液滴表面固化膜的破裂，引起液滴破碎、合并、粘連，液滴表面固化膜厚度不均勻，形狀不完整、大小不均一；若無攪拌，得到的球形產(chǎn)品形狀完整、大小均一。因此，滴入液滴的初始階段可采取不攪拌操作。

2.8 殼聚糖微球載體制備

殼聚糖微球載體制備的最佳條件：將20 g／L殼聚糖（1%冰乙酸）溶液，以距離凝結(jié)液面20～30 cm的高度滴入終濃度20%NaOH和30%甲醇的凝結(jié)液中，不攪拌。制得的殼聚糖微球載體形狀完整，大小均一，具有彈性。

用游標(biāo)卡尺測量殼聚糖微球載體平均直徑為（4.00±0.06）mm，平均重量為（30.80±0.02）mg／個，每個殼聚糖微球載體的比表面積為4.08×10－4m2／g。

1 Majeti N V，Ravi Kumar.A review of chitin and chitosan applications［J］.Reactive and factional polymers，2000，46（1）：1～27.

2 張彥軍，田豐，陳世謙.殼聚糖固定化酶的制備及應(yīng)用［J］，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2002，26（3）：225～227.

3 劉思聰.β－D－半乳糖苷酶殼聚糖固定方法、特性及應(yīng)用研究［D］.陜西：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2006.

4 Abdel－Naby M A，Ismail A M S，Ahmed S A，et al.Production and immobilization of alkaline protease from Bacillusmycoides［J］.Bioresour Tech.，1998，64（3）：205～210.

5 Pifferi PG，Bonora V，Spagna G，et al.Immobilization of catalase on macromolecular supports activated with acid dyes［J］.Process Biochem，1993，28（1）：29～38.

6 Martino A，Durante M，Pifferi P G，et al.Immobilization of bete－glucosidase from a commercial preparation.Part 1.A comparative study of natural supports［J］.Process Biochem，1996，31（3）：281～285.

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8 陳盛，李柱來.殼聚糖固定化脲酶研究［J］.中國生物工程雜志，1992，12（5）：40～43.

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11 陳天.殼聚糖固定化胰蛋白酶的研究［J］.離子交換與吸附，2002，18（2）：125～131.

Study of preparation conditions of food－grade immobilization support－chitosan microsphere

WU Qiao－li1ZHANG Shao－fan3SUN Yang2QIAN Fang1

（1.College of Food Science and Technology，Dalian Polytechnic University，Dalian，Liaoning116034，China；2.Ji Lin Province Light Industry Design and Research Institude，Jilin，Changchun，130012，China；3.College of Information Science and Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian，Liaoning116034，China）

The research studied the optimum preparation condition of chitosan immobilization microspheres support，and provided theoretical foundation for the further its immobilization on lactase.The chitosan microsphere was prepared by condensation／precipitation.The results showed that 2g／m L chitosan（1%ice acid solution）was dropped into concretion solution，which was composed of 20%NaOH and 30%methanol in final concentration，and not stirred when the reaction began.The diameter，the average weight and the specific surface area of every support was 4.00±0.06 mm，30.80±0.02 mg，and 4.08×10－4m2／g under the conditions.Thus the chitosan support is produced，which is uniform in size，integrated in shape，fine in flexibility.

chitosan；microsphere support；immobilization

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.01.005

國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項目（編號：2011B0002004）；遼寧省教育廳項目（編號：L2010053）；遼寧省科學(xué)技術(shù)基金項目（編號：201102110）

吳巧麗（1985－），女，大連工業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。E－mail：qf09＠163.com

錢方

2011－10－30