利用dsDNA層層膜檢測(cè)芬頓試劑對(duì)天然DNA的損傷

(甘肅工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化工學(xué)院，甘肅天水74025)

利用dsDNA層層膜檢測(cè)芬頓試劑對(duì)天然DNA的損傷

廖天錄，劉軍

(甘肅工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化工學(xué)院，甘肅天水74025)

憑借聚陽離子聚乙烯亞胺(PEI)和帶負(fù)電荷的DNA存在的相互之間的靜電作用交替吸附在玻碳電極表面，進(jìn)而形成非常有序的{dsDNA/PEI}2層層膜.采用槲皮素作為電活性指示劑來檢測(cè)芬頓試劑對(duì)天然dsDNA的損傷.由于槲皮素在DNA多層膜中具有的非常特別的可逆吸入模式，這中模式能夠明顯分辨損傷和未損傷DNA多層膜的吸入量.由此檢測(cè)芬頓反應(yīng)引起的DNA的氧化性損傷，可以提供一種新的檢測(cè)DNA損傷的電化學(xué)方法.

dsDNA層層膜;芬頓試劑;槲皮素;DNA損傷

DNA是生物遺傳信息的基本載體.一般它的分子結(jié)構(gòu)不會(huì)在活動(dòng)過程中改變，然而，生物體內(nèi)外部的一些物理和化學(xué)因素很有可能使得它的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化，這就稱為是DNA的損傷［1］.所以，研究DNA損傷的檢測(cè)具有重大意義，它對(duì)于新化合物的毒性篩選、生物污染物的檢控以及生態(tài)毒性學(xué)研究具有現(xiàn)實(shí)意義.電化學(xué)方法是檢測(cè)DNA損傷的一種新的可選擇的檢測(cè)手段［2－3］，它具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏、價(jià)格低等諸多優(yōu)點(diǎn).過氧化氫與催化劑Fe2+構(gòu)成的氧化體系通常稱為芬頓試劑.芬頓反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基對(duì)DNA的損傷已得到證實(shí)［4］.本文中，采用槲皮素作為電活性指示劑與dsDNA的嵌入作用來檢測(cè)芬頓試劑對(duì)天然DNA的損傷.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

聚乙烯亞胺(PEI，MW－1800)購(gòu)于Alfa Aesar公司;小牛胸腺DNA(北京華美生物工程公司);雙氧水(H2O2，質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%)購(gòu)于天津市化學(xué)試劑公司;硫酸亞鐵(FeSO4)購(gòu)于與成都臨江化工廠;槲皮素購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院蘭州化物所;其它所用試劑均是分析純，水是于4℃條件下儲(chǔ)存的二次蒸餾水.在每次試驗(yàn)前均需用高純度氮?dú)獬パ鯕?除了DNA損傷的實(shí)驗(yàn)外所有實(shí)驗(yàn)都是在室溫(20±2)℃下進(jìn)行的.本實(shí)驗(yàn)所用的0.1mol/L醋酸鹽緩沖溶液(pH=5.0)均需進(jìn)行CV測(cè)試.

1.2 儀器

CHI832電化學(xué)工作站(美國(guó))上完成，Branson200超聲清洗儀(美國(guó));pHS－3C型酸度計(jì)(上海);石英管加熱式自動(dòng)雙重純水蒸餾器(1810B，上海亞太技術(shù)玻璃公司)，玻碳電極的直徑是3.5mm.

1.3 實(shí)驗(yàn)過程

(1)先用0.1μm和0.05μm的拋光粉對(duì)玻碳電極分別進(jìn)行拋光，之后將拋光好的玻碳電極放到超聲清洗器里使用準(zhǔn)備好的丙酮和二次水分別進(jìn)行5分鐘的清洗，接下來再用氮?dú)鈱⑵浯蹈?之后再將該電極交替分別浸入到聚乙烯亞胺和dsDNA中各10分鐘，直至他們能夠交替吸附到電極表面，這中間還需用二次水沖洗，此時(shí)會(huì)形成一層膜它就是{dsDNA/PEI}膜.然后依據(jù)設(shè)計(jì)好的膜層數(shù)再對(duì)上述實(shí)驗(yàn)過程操作2次，最后可以獲得多層膜{dsDNA/PEI}2.

(2)室溫下在5mL電解池中進(jìn)行循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn).工作電極為裸玻碳電極、DNA修飾電極或DNA與槲皮素產(chǎn)物的修飾電極.鉑電極為對(duì)電極，Ag/AgCl(飽和KCl)為參比電極.

(3)槲皮素吸入上面的多層膜是通過將該膜電極浸泡在1×10－4mol/L槲皮素緩沖溶液(pH=5.0，含0.1M NaCl)里，不斷攪拌至少2小時(shí)直到達(dá)到吸入平衡或穩(wěn)定狀態(tài).此時(shí)吸入槲皮素量最多狀態(tài)的膜就被指定為{dsDNA/PEI}2－QC膜，然后利用醋酸緩沖液對(duì)該膜進(jìn)行清洗并用氮?dú)獯蹈桑髮⑺湃氲酱姿峋彌_液中進(jìn)行CV掃描.在此狀態(tài)的DPV氧化峰電流就被定為I0.之后把該狀態(tài)的該膜在醋酸緩沖液中進(jìn)行浸泡一夜，使QC從膜中最大限度的釋放出來，而且還需不間斷的把該膜放入醋酸緩沖溶液中進(jìn)行CV掃描.而針對(duì)DNA損傷實(shí)驗(yàn)，我們需要把充分吸附了槲皮素的該膜放入到緩沖液中1小時(shí)使盡可能多的在膜中非特殊鍵合槲皮素釋放出來［5］.然后將該膜放入到含硫酸亞鐵(1.5mmol/L)和雙氧水(0.5mol/L)的醋酸鹽緩沖溶液中［6］，并在37℃下攪拌一段時(shí)間對(duì)DNA的損傷.為了除去DNA膜上吸附的芬頓試劑與非特殊鍵合槲皮素，再把損傷的該膜放入到緩沖溶液中浸泡1小時(shí).之后將損傷的該膜放入醋酸緩沖液中CV掃描，此時(shí)CV氧化峰電流指定為It.而且每次檢測(cè)對(duì)上述過程至少重復(fù)3次，DNA損傷實(shí)驗(yàn)都在暗室中進(jìn)行.

2 結(jié)果和討論

把充分吸附了槲皮素的{dsDNA/PEI}2－QC膜先浸泡到緩沖液里1小時(shí)為使更多的在膜中非特殊鍵合槲皮素能夠釋放出來［6］.然后使該膜在芬頓試劑中37℃下溫浴并攪拌一定時(shí)間對(duì)DNA損傷.為了除去吸附于膜上的芬頓試劑和非特殊鍵合槲皮素.還需再將DNA受損傷的膜浸泡于緩沖液中1小時(shí)，浸泡之后立即將吸入大量槲皮素的膜電極放入到醋酸緩沖液中進(jìn)行CV測(cè)試.圖1是該膜在芬頓試劑中溫浴不同時(shí)間的循環(huán)伏安圖.從該圖不難看出，隨著溫浴時(shí)間的不斷增加，氧化還原峰電流反而不斷減小.此現(xiàn)象說明受損傷的dsDNA多層膜能夠吸入的槲皮素根本不能達(dá)到未損傷的dsDNA多層膜吸入的槲皮素的相同水平，對(duì)dsDNA在{dsDNA/PEI}2中的損傷檢測(cè)是通過循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)進(jìn)行.實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)膜電極只能循環(huán)使用一次.為了保證膜電極變化的真實(shí)性，必須使用新制成的膜電極重復(fù)實(shí)驗(yàn).

通過氧化峰電流的比率與膜在芬頓試劑中溫浴時(shí)間的斜率可以測(cè)定dsDNA在該膜中的損傷率(圖2)，其中，I0和It分別是該膜在芬頓試劑溶液中沒有溫浴和溫浴時(shí)間t(t在10分鐘之內(nèi))的氧化峰電流.用相對(duì)峰電流的比率代替絕對(duì)峰電流是為了有效的測(cè)定DNA的損傷.相對(duì)峰電流的比率隨著在芬頓試劑溶液中溫浴時(shí)間線性增加，損失率為0.3843min－1，相關(guān)系數(shù)為0.9981，證明了我們建立在以槲皮素作為電活性指示劑與dsDNA層層膜相結(jié)合的基因毒性傳感器可以有效的檢測(cè)DNA損傷.

在含亞鐵離子的酸性液中添加一定量的過氧化氫時(shí)，H2O2能夠生成一種氫氧自由基(Fe2+作為催化劑)，又因?yàn)榱u基自由基可以產(chǎn)生對(duì)DNA的氧化損傷，進(jìn)而導(dǎo)致DNA的鏈產(chǎn)生斷裂，從而生成8－氧鳥嘌呤(8－oxo－G)和一些其它的加合物［7－8］.芬頓反應(yīng)誘導(dǎo)氧化DNA將擾亂或完全破壞一些在DNA雙螺旋鄰近堿基對(duì)形成的π－π堆積.在我們的實(shí)驗(yàn)中，由于槲皮素分子能夠嵌入到DNA雙螺旋鄰近堿基對(duì)當(dāng)中，因此才有大量的槲皮素分子吸入到{dsDNA/PEI}2膜，尤其是浸入到緩沖溶液中1小時(shí)之后，損傷的DNA就能夠從受到破壞的雙螺旋結(jié)構(gòu)中把大量的槲皮素分子釋放出，此時(shí)的CV響應(yīng)會(huì)減小，這也說明在最初10分鐘之內(nèi)相對(duì)峰電流的比率隨著在芬頓試劑中溫浴時(shí)間的增加而線性增加，這是因?yàn)榱u基自由基不穩(wěn)定，而且存在的時(shí)間也較短，然而在溫浴10分鐘以后，反而CV的峰電流不再會(huì)隨著溫浴時(shí)間的增加而減少.這其中的原因是在溫浴最初的10分鐘之內(nèi)膜中易受損傷的DNA的活性點(diǎn)已經(jīng)完全消耗殆盡.

圖1 充分吸附了槲皮素的{dsDNA/PEI}2－QC膜在芬頓試劑溶液中溫浴不同時(shí)間的循環(huán)伏安

圖2 氧化峰電流的比率與{dsDNA/PEI}2－QC膜在芬頓試劑溶液中溫浴時(shí)間的斜率

3 結(jié)束語

本文采用槲皮素作為電活性指示劑吸入{dsDNA/PEI}2膜，進(jìn)而憑借芬頓試劑對(duì)天然DNA損傷進(jìn)行檢測(cè)，由于槲皮素所擁有的DNA多層膜中的非常特別的可逆吸入方式，憑借它我們可以很好分辨出槲皮素在損傷和未損傷DNA多層膜中的吸入量，并將槲皮素從膜中的漏泄量減少到最小.槲皮素能夠嵌入到雙鏈DNA與其結(jié)合.因此{(lán)dsDNA/PEI}2－QC能夠成功檢測(cè)出芬頓試劑對(duì)天然DNA的損傷.該膜系統(tǒng)將為我們今后找到更多合適體系檢測(cè)DNA的損傷提供了引導(dǎo).作為DNA損傷傳感器可以為化學(xué)損傷DNA提供一個(gè)普遍的、靈敏的檢測(cè)方法.

［1］Babkina S S，Ulakhovich N A.Complexing of Heavy Metals with DNA and New Bioaffinity Method of Their Determination Based on Amperometric DNA－Based Biosensor［J］.Anal.Chem.，2005，77:5678－5685.

［2］Palecek E，F(xiàn)ojta M，Tomschik M，Wang J.Electrochemical Biosensors for DNA Hybridization and DNA Damage［J］.Biosens Bioelectron，1998，13(6):621－628.

［3］Tianlu Liao，Yanfeng Wang，Xibin Zhou，et al.Detection of DNA damage induced by styrene oxide in dsDNA layer－by－layer films using adriamycin as electroactive probe［J］.Colloids and Surfaces B，2010，76(1):334－339.

［4］Zhenyu Lin，Jianjun Sun，Jinhua Chen，et al.Electrochemiluminescent Biosensor for Hypoxanthine Based on the Electrically Heated Carbon Paste Electrode Modified with Xanthine Oxidase［J］.Anal.Chem.，2008，80(8):2826－2831.

［5］Lu X Q，Chen Y N，Chen J，Zhang Y，et al.Electrochemical Studies of the Interaction of Quercetin with DNA［J］.Int.J.Electrochem.Sci.，2006(1):130－138.

［6］Elicia L S，Wong and J，Justin Gooding.Charge Transfer through DNA:A Selective Electrochemical DNA Biosensor［J］.Anal.Chem.，2006，78(7):2138－2144.

［7］Halliwell B.Oxygen and nitrogen are pro－carcinogens.Damage to DNA by reactive oxygen，chlorine and nitrogen species:measurement，mechanism and the effects of nutrition［J］.Mutat Res，1999，443:37－52.

［8］Floyd R A.The role of 8－h(huán)ydroxyguanine in carcinogenesis［J］.Carcinogenesis，1990(11):1447－1450.

Q523

A

1008－7974(2012)08－0021－02

2011年甘肅省天水市市級(jí)財(cái)政專項(xiàng)資金項(xiàng)目;甘肅工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院基金項(xiàng)目(Gzy2011－17).

2011－10－23

廖天錄(1974－)，甘肅天水人，碩士，甘肅工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化工學(xué)院講師.

(責(zé)任編輯:水行)