PCDHα在髓鞘形成和少突膠質細胞發育中的作用

于 鈺，索 倫， 吳 強

(上海交通大學 系統生物醫學研究院, 上海 200240)

PCDHα在髓鞘形成和少突膠質細胞發育中的作用

于 鈺，索 倫， 吳 強*

(上海交通大學 系統生物醫學研究院, 上海 200240)

該文通過免疫組化及蛋白免疫印跡的方法分別對Pcdhα基因敲除和對照組小鼠的中樞神經系統內的髓鞘堿性蛋白表達以及少突膠質細胞的發育進行了測定。結果表明：1)Pcdhα基因缺失小鼠中樞神經系統中的髓鞘堿性蛋白較對照組小鼠明顯減少；2)Pcdhα基因敲除可導致少突膠質細胞發育異常：在小腦中, 處于成熟期的少突膠質細胞減少, 而處于前體細胞階段的少突膠質細胞增多。上述結果提示 Pcdhα可以通過調控少突膠質細胞的成熟過程進而影響髓鞘的形成。

原鈣黏蛋白；髓鞘；少突膠質細胞；發育

Pcdh是廣泛分布于中樞神經系統的一類跨膜蛋白, 根據基因結構分為非成簇原鈣黏蛋白(Nonclustered Pcdh)和成簇原鈣黏蛋白(Clustered Pcdh)。成簇Pcdh基因包含三個串聯的基因簇——Pcdhα、β和γ。其中Pcdhα和Pcdhγ分別由14和 22個可變區及各自共同的恒定區組成, 并通過基因的可變剪接編碼36種Pcdh分子, 而Pcdhβ則由 22個可變區進行單獨編碼(Wu & Maniatis,1999)。多樣性的Pcdh分子通過同嗜或異嗜結合的方式特異性地表達于神經元的細胞膜上, 并影響神經細胞間的特異性鏈接(Weiner et al. 2005;Schreiner & Weiner, 2010; Takeichi, 2007)。Pcdh 分子還可以通過其胞內結構域與其它胞內蛋白相互作用,進而影響神經細胞的存活(Emond & Jontes, 2008;Fernández-Monreal et al, 2009, Han et al, 2010)。

本課題組在前期的研究中對神經元跨膜蛋白原鈣黏蛋白(Pcdhα)敲除小鼠的行為學觀察發現,該小鼠表現出典型的焦慮及強迫性抓撓行為, 致使頭頸部皮膚脫毛, 出現嚴重的非病理性皮膚損傷。進一步分析發現, 該基因廣泛分布于神經元的胞體及樹突膜上并可以明顯引起海馬神經元樹突發育異常和樹突棘減少, 最終嚴重阻礙了小鼠正常的神經傳導通路(Preparation for publication)。脫髓鞘疾病多發性硬化癥和腦白質營養不良困擾人類很多年, 目前科學家還未發現能夠徹底治愈低髓鞘化疾病有效的方法。有研究表明, 在人類中幼兒時出現的中樞神經系統低髓鞘化伴隨有Pcdhα突變(Shimojima et al, 2011)。然而,Pcdhα基因敲除小鼠是否影響髓鞘的形成, 以及該基因是通過何種途徑來調控髓鞘的發育目前還尚不清楚。

為此, 本研究以Pcdhα基因敲除小鼠為研究對象，通過免疫組化及蛋白生化分析的方法對Pcdhα基因敲除對小鼠髓鞘形成及與之密切相關的少突膠質細胞的發育的影響進行研究。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

Pcdhα基因敲除小鼠(Cre-Loxp系統敲除制備,Cre表達小鼠品系為C57BL6, 由本實驗室提供, 遺傳背景為C57BL6)。所有動物飼養于室溫 (22士1)℃,自由攝食與飲水, 12h光照/12h黑暗期飼養。所有的實驗都在遵循國家實驗動物指南的基礎上進行。

一抗：Rat anti-Myelin Basic protein(Millipore),Rabbit Anti-NG2 chondroitin sulfate proteoglycan(Millipore), Mouse anti-O4(Millipore), Mouse GFAP antibody(Millipore), Mouse NF200 antibody (Millipore),Rabbit Tau antibody(Millipore), Rabbit polyclonal to βactin(Millipore)。

二抗：Donkey anti-mouse IgG Dylight 488(Jackson immuno Research), Goat anti-rat IgG-FITC(Invitrogen), IRDye 800 Goat Anti-Rat IgG(LI-COR Bioscience), IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG(LI-COR Bioscience), IRDye 800 Goat Anti-Mouse IgG(LI-COR Bioscience)。

1.2 基因型鑒定

鼠尾基因組DNA的PCR檢測：1) 按照常規方法進行鼠尾基因組DNA的提取; 2) 采用如下引物及PCR程序進行基因型鑒定：ConF1: AGGCT GAATAACGTGCACAGCTAAG; GFPmutF: CCCCC TGAACCTGAAACATAAAATG; ConR1: GCAGAT TGGTTCAATGGAGTCTTT。PCR反應條件為：94 ℃2 min; 94 ℃ 30 s, 59.5 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 35 個循環; 72 ℃ 3 min。1.5%的瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。

1.3 免疫組化

分別取10、21日齡Pcdhα基因敲除小鼠和對照組小鼠各6只麻醉后，經4%多聚甲醛灌注后完整取出小鼠腦組織置于 4%多聚甲醛溶液中 4℃固定過夜, 再分別經15%和30%蔗糖溶液脫水處理至沉入瓶底后進行常規 OCT包埋及冰凍切片。根據小鼠大腦圖譜（Paxinos & Franklin, 2001），小鼠腦組織徑向連續切片(厚 30 μm)貼于載玻片上。免疫組織化學染色按照試劑盒進行, 一抗（rat anti-myelin basic protein 1:500, rabbit anti-NG2 1:200, mouse anti-O4 1:50）孵育4 ℃過夜, 經PBS充分漂洗后加入對應二抗（goat anti rat FITC, 1:20, goat anti rabbit Alex488, 1:1 000, goat anti mouse Alex488,1:1 000）室溫下孵育1 h, DAPI溶液封片后在ZEISS熒光顯微鏡下進行圖片采集。采集圖片在Axiovision Rel7.0軟件中進行圖像分析。

1.4 Western blotting

分別取10、21日齡Pcdhα基因敲除小鼠與對照組小鼠脫頸處死, 在顯微鏡下快速將小腦, 腦干和大腦迅速分離后電子天平稱重, 按照每20 mg組織加入 100～200 μL裂解液的比例加入裂解液(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 1%TritonX-100, 0.5% 脫氧膽酸鈉, 0.1%SDS, protease inhibitors cocktail)。組織破碎 5 min, 充分裂解后,14 000g離心3～5 min后取上清, 樣品進行BCA法進行蛋白定量后加入等體積的2×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液, 95℃水浴加熱 3～5 min, 進行SDS-PAGE電泳, 轉膜處理。轉膜后NC膜用5%脫脂奶室溫封閉 1 h后在一抗中 4 ℃孵育過夜, 用TBST清洗5 min×3次, 室溫孵育熒光二抗1 h, 用TBST清洗5 min×3次, 最后用Odyssey紅外雙色激光成像系統掃描。

2 結 果

2.1 Pcdhα基因敲除對髓鞘形成的影響

中樞神經系統髓鞘由70%脂質和30%蛋白質構成，其中髓鞘堿性蛋白（Myelin basic protein, MBP）占蛋白部分的1/3，它不但是髓鞘的主要組成部分，還能起到穩定微管結構的作用。因此，MBP的測定是中樞神經系統中有無髓鞘缺失的重要的指標。在正常小鼠中樞神經系統中，該蛋白在出生時主要在腦干處有少量表達，MBP表達量最高峰發生在小鼠出生21 d。此時，該蛋白不僅廣泛分布于小腦葉中，在大腦的胼胝體中也高度表達。由于可變剪切的作用MBP蛋白形成4個亞型。實驗取同一窩出生的小鼠，通過PCR鑒定基因型，Pcdhα基因敲除雜合小鼠作對照組，Pcdhα基因敲除純合小鼠為實驗組（圖1）。

本研究免疫組化染色結果表明：21日齡Pcdhα基因敲除純合小鼠髓鞘在腦干處的差異不明顯，但在小腦和大腦中髓鞘的形成呈現延遲的狀況(圖2)，在軸突束最為集中的胼胝體尤其顯著(圖2G, J)。

圖1 基因型鑒定結果Fig. 1 Genotyping results

圖2 21日齡純合小鼠與對照組小鼠中樞神經系統白質的髓鞘化的不同(10×)Fig. 2 Myelination differences on white matter of CNS between control and Pcdhα-/- mice(10×magnification)

為了進一步驗證上述結果，本研究對 21日齡小鼠的大腦、小腦和腦干分別采集后進行免疫印跡分析，結果顯示：MBP 4種亞型的蛋白量都出現不同程度地減少，尤其是在小腦和大腦中比較顯著(圖3), 驗證了免疫組化的結果。所以，我們得出結論：Pcdhα敲除確實導致了小鼠髓鞘的形成缺陷。

2.2 Pcdhα基因敲除對少突膠質細胞發育的影響

圖3 21日齡Pcdhα-基因敲除純合小鼠和對照組小鼠在中樞神經系統中MBP的表達量差別Fig. 3 Difference in myelination revealed by MBP expression between control mice and Pcdhα-/- mice 21 day after birth

在哺乳動物中樞神經系統中，髓鞘主要由成熟少突膠質細胞將細胞膜圍繞軸突多次螺旋纏繞壓縮形成。少突膠質細胞經過多潛能神經干細胞期、少突膠質細胞祖細胞期、少突膠質細胞前體細胞期和未成熟的少突膠質細胞期，最終發育成為成熟的少突膠質細胞，成熟的少突膠質細胞可以發射出很多突起，分別包埋軸突，形成髓鞘 (Baumann &Pham-Dinh, 2001)。少突膠質細胞在發育不同階段特異性的表達不同蛋白，而整個少突膠質細胞的發育又是伴隨著一些蛋白的消失和另外一些標記蛋白的產生。其中NG2(CPSG4)是一類硫酸軟骨素蛋白多糖，主要在少突膠質前體細胞中表達，而在成熟的少突膠質細胞中消失。少突膠質細胞開始成熟時，能夠大量合成硫脂和糖脂，從而可以被O4的抗體所識別。所以，可以分別用NG2和O4標記少突膠質前體細胞和成熟的少突膠質細胞。再次利用Pcdhα敲除的小鼠去探索少突膠質細胞的發育，結果顯示與對照組相比，Pcdhα敲除小鼠小腦中少突膠質前體細胞(NG2+細胞)顯著增加(圖4A, B)。相反，成熟少突膠質細胞(O4+細胞)則明顯減少(圖 4C,D)。此外，Western blotting結果同樣表明，Pcdhα敲除小鼠小腦中少突膠質前體細胞顯著增加(圖 4E)。

圖4 10日齡Pcdhα基因敲除純合小鼠與對照組小鼠在小腦處NG2著色和O4著色的細胞數目上呈現出不同的現象(10×)Fig. 4 Different phenotype of NG2 and O4 cell number in the cerebellum of Pcdhα-/- and control mice 10 days after birth (10×magnification)

2.3 Pcdhα基因敲除引起的與髓鞘相關水平的變化

星形膠質細胞對于髓鞘外部環境的維護起到重要作用(Ishibashi et al, 2006)。此外，髓鞘形成的延遲或脫髓鞘化小鼠中樞神經系統內經常伴隨著軸突的損傷、變性或消失(Fancy et al, 2011)。本課題組采集 21日齡小鼠大腦進行蛋白免疫印跡，結果顯示，Pcdhα基因敲除對星形膠質細胞標記蛋白（GFAP）以及軸突標記蛋白（NF200和Tau）均無顯著影響（圖5）。

圖5 Pcdhα基因敲除對小鼠大腦星形膠質細胞和軸突的影響Fig. 5 Effect of Pcdhα gene knockout on axonal and astrocyte protein markers in the mouse cerebrum

3 討 論

Pcdhα基因敲除小鼠中樞神經系統中存在普遍的低髓鞘化現象，與此同時也伴隨著大量少突膠質細胞前體細胞的聚集，但成熟的少突膠質細胞數目卻有減少的趨勢。由于只有成熟的少突膠質細胞才具有形成髓鞘的潛能，大量存在的少突膠質細胞前體有可能導致了小鼠的低髓鞘現象。我們的結論是Pcdhα的確在少突膠質細胞前體到成熟的少突膠質細胞的這個階段中起作用。同時，本研究結果顯示,在個體成熟的基因敲除小鼠中，軸突沒有因為低髓鞘化而出現變性，消失或損傷的表型。這可能是由于在成年Pcdhα基因敲除小鼠體內存在某種能使軸突再髓鞘化的信號，從而吸引更多的少突膠質細胞前體能夠再次聚集到低髓鞘化的軸突上。然而，由于Pcdhα基因的缺失，這些前體細胞無法發育成具有形成髓鞘功能的少突膠質細胞。所以，本項研究為將來基因治療人類脫髓鞘疾病提供了依據。

致謝：感謝上海交通大學系統生物醫學研究院李偉老師在實驗上的幫助, 感謝魯慧囡、陸宇嘉同學在實驗技術上給予的建議。

Baumann N, Pham-Dinh D. 2001. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system [J].Physiol Rev,81(2):871-927.

Emond MR, Jontes JD. 2008. Inhibition of protocadherin-α function results in neuronal death in the developing zebrafish [J].Dev Biol,321(1):175-187.

Fancy SPJ, Chan JR, Baranzini SE, Franklin RJM, Rowitch DH. 2011.Myelin regeneration: a recapitulation of development? [J].Annu Rev Neurosci,34: 21-43.

Fernández-Monreal M, Kang S, Phillips GR. 2009. Gamma-protocadherin homophilic interaction and intracellular trafficking is controlled by the cytoplasmic domain in neurons [J].Mol Cell Neurosci,40(3): 344-353.

Han MH, Lin C, Meng SX, Wang XZ. 2010. Proteomics analysis reveals overlapping functions of clustered protocadherins [J].Mol Cell Proteomics,9(1): 71-83.

Ishibashi T, Dakin K A, Stevens B, Lee P R, Kozlov S V, Stewart C L,Fields R D. 2006. Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses [J].Neuron,49(6): 823-832.Paxinos G, Franklin K B J. 2001. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates [M]. 2nd ed. New York: Academic Press: 101-112.

Schreiner D, Weiner JA. 2010. Combinatorial homophilic interaction between γ-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion [J].Proc Natl Acad Sci USA,107(33):14893-14898.

Shimojima K, Isidor B, Le Caignec C, Kondo A, Sakata S, Ohno K,Yamamoto T. 2011. A new microdeletion syndrome of 5q31.3 characterized by severe developmental delays, distinctive facial features, and delayed myelination [J].Am J Med Genet A,155A(4):732-736.

Takeichi M. 2007. The cadherin superfamily in neuronal connections and interactions [J].Nat Rev Neurosci,8(1): 11-20.

Weiner JA, Wang XZ, Tapia JC, Sanes JR. 2005. Gamma protocadherins are required for synaptic development in the spinal cord [J].Proc Natl Acad Sci USA,102(1): 8-14.

Wu Q, Maniatis T. 1999. A striking organization of a large family of human neural cadherin-like cell adhesion genes [J].Cell,97(6): 779-790.

Protocadherin α gene cluster is required for myelination and oligodendrocyte development

YU Yu, SUO Lun, WU Qiang*

(Shanghai Center for Systems Biomedicine,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai200240,China)

This work used Immunohistochemistry to examine the expression of myelin basic protein and accumulation of oligodendrocytes inPchdαknockout and control littermate mice. Data showed that inPchdαknockout mice, Myelin proteins decrease in the central nervous system and mature oligodendrocytes in the cerebellum also decrease. Furthermore, deletion of the Pcdhα cluster does not cause any change to the axons and astrocytes in quantification of relative marker proteins. These findings suggest that the Pcdhα cluster may be required for myelination and oligodendrite development of the brain in mice, and that Pcdhα cluster may play a key role in the development of the central nervous system.

Protocadherin; Myelin; Oligodendrocyte; Development

Q952.5; Q42

A

0254-5853-(2012)04-0362-05

10.3724/SP.J.1141.2012.04362

2012-04-20；接受日期：2012-07-06

國家自然科學基金資助項目(31171015)

?通信作者(Corresponding author)，E-mail: qwu123@gmail.com

于鈺(1985—), 女, 碩士研究生, 研究方向為生物化學與分子生物學, E-mail: sduyuyu@yahoo.com.cn