萬(wàn)壽菊殺菌素水乳劑對(duì)尖孢鐮刀菌侵染活性的影響

孫芬變，王金勝

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

尖孢鐮刀菌侵染引起的植物枯萎病是一種世界性的土傳真菌病害，病菌及其產(chǎn)生的膠狀物能夠通過(guò)侵染植物的導(dǎo)管[1]，從而使植物缺水萎蔫；也可以通過(guò)與植物相互作用產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶類從而破壞植物。萬(wàn)壽菊殺菌素是由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院相關(guān)課題組研制合成的，是在經(jīng)過(guò)對(duì)萬(wàn)壽菊根粗提物中抑菌活性成分分離與分析鑒定以后，人工模擬合成的一類精油類殺菌制劑[2]。該藥劑對(duì)尖孢鐮刀菌的殺滅效果良好[3-4]。但是，關(guān)于殺菌劑對(duì)尖孢鐮刀菌侵染活性的作用機(jī)理目前報(bào)道尚少。

本試驗(yàn)應(yīng)用生理生化的方法研究了萬(wàn)壽菊殺菌素水乳劑對(duì)尖孢鐮刀菌侵染活性的影響，初步探索萬(wàn)壽菊殺菌素防治尖孢鐮刀菌侵染活性的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

尖孢鐮刀菌西瓜專化型（Fusarium oxysporum f.sp niveum（E.F.Smith）Snyder Hansen），由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供；萬(wàn)壽菊殺菌素水乳劑，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院相關(guān)課題組研制合成。

1.2 方法

1.2.1 PDA 液體培養(yǎng)基 稱取去皮切塊土豆200 g，加水1 000 mL 煮沸30 min，雙層紗布過(guò)濾，補(bǔ)充水分至1 000 mL，分裝在10 個(gè)100 mL 三角瓶中，每個(gè)三角瓶分別加入2 g 的葡萄糖，用牛皮紙封口，于121 ℃滅菌20 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌液的制備 在5 個(gè)250 mL 的無(wú)菌三角瓶中分別加入100 mL PDA 液體培養(yǎng)基，加入2個(gè)直徑為6 mm 的菌餅接種，于25 ℃，120 r/min培養(yǎng)60 h。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)CK 和A，B，C，D 共5個(gè)處理，即每個(gè)三角瓶的菌液中分別按照終濃度0，0.1，0.2，0.3，0.4 μg/mL 加入相應(yīng)量的萬(wàn)壽菊殺菌素水乳劑，每個(gè)處理3 次重復(fù)。

1.2.4 尖孢鐮刀菌電導(dǎo)值的測(cè)定 每隔24 h 取培養(yǎng)液5 mL，3 000 r/min 離心15 min，棄上清液，稱取0.5 g 菌絲體（沉淀），用去離子水反復(fù)沖洗3 次后，加去離子水10 mL，靜置30 min，測(cè)定電導(dǎo)值[5-6]。用電導(dǎo)值的變化衡量細(xì)胞膜透性的變化。

1.2.5 尖孢鐮刀菌纖維素酶和β-D- 葡萄糖苷酶活性的測(cè)定 每隔24 h 按照李合生[7]的方法進(jìn)行尖孢鐮刀菌纖維素酶活性和β-D- 葡萄糖苷酶活性的測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 萬(wàn)壽菊殺菌素水乳劑對(duì)尖孢鐮刀菌細(xì)胞膜透性的影響

不同質(zhì)量濃度萬(wàn)壽菊殺菌素水乳劑處理尖孢鐮刀菌后，尖孢鐮刀菌菌膜透性的變化如圖1所示。尖孢鐮刀菌菌膜電導(dǎo)值的變化直接反映了其細(xì)胞膜的通透程度。

從圖1 可以看出，同一處理時(shí)間下，電導(dǎo)值大小為處理D＞C＞B＞A＞CK，即隨著萬(wàn)壽菊殺菌素水乳劑質(zhì)量濃度的逐漸增加，電導(dǎo)值也隨之增大。說(shuō)明萬(wàn)壽菊殺菌素水乳劑作用于尖孢鐮刀菌細(xì)胞膜會(huì)增加細(xì)胞膜的通透性，引起電解質(zhì)外滲，進(jìn)而抑制尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)。

2.2 萬(wàn)壽菊殺菌素水乳劑對(duì)尖孢鐮刀菌侵染力的影響

2.2.1 萬(wàn)壽菊殺菌素水乳劑對(duì)尖孢鐮刀菌纖維素酶活性的影響 圖2 為萬(wàn)壽菊殺菌素水乳劑處理后，尖孢鐮刀菌纖維素酶活性的變化情況。

從圖2 可以看出，隨著對(duì)照組尖孢鐮刀菌不斷的增殖，其纖維素酶活性也呈現(xiàn)出緩慢增長(zhǎng)，在72 h 后呈現(xiàn)出基本平穩(wěn)的水平波動(dòng)趨勢(shì)；而萬(wàn)壽菊殺菌素水乳劑處理的A，B，C，D 的纖維素酶水平則呈現(xiàn)出起伏不定，但是總體水平明顯低于對(duì)照，且隨著萬(wàn)壽菊殺菌素水乳劑添加量的增加，纖維素酶活性降低得越明顯。說(shuō)明萬(wàn)壽菊殺菌素水乳劑可以降低纖維素酶活性。

2.2.2 萬(wàn)壽菊殺菌素水乳劑對(duì)尖孢鐮刀菌β-D-葡萄糖苷酶活性的影響 圖3 為萬(wàn)壽菊殺菌素水乳劑處理對(duì)尖孢鐮刀菌β-D- 葡萄糖苷酶活性的影響。

從圖3 可以看出，隨著對(duì)照組尖孢鐮刀菌不斷的增殖，其β-D- 葡萄糖苷酶活性呈現(xiàn)出緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì)。而萬(wàn)壽菊殺菌素水乳劑處理的A，B，C，D 的β-D- 葡萄糖苷酶活性隨處理時(shí)間的增加呈下降趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，明顯下降，且隨著萬(wàn)壽菊殺菌素水乳劑添加量的增加，β-D- 葡萄糖苷酶活性降低得越明顯。說(shuō)明萬(wàn)壽菊殺菌素水乳劑可以降低β-D- 葡萄糖苷酶活性。

3 討論

長(zhǎng)期使用傳統(tǒng)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境造成污染，給推動(dòng)農(nóng)業(yè)發(fā)展帶來(lái)很多的不利影響[8]。本試驗(yàn)表明，萬(wàn)壽菊殺菌素水乳劑作為一種生物農(nóng)藥，能夠使尖孢鐮刀菌膜的透性增加，即當(dāng)病原菌細(xì)胞膜的透性被破壞，病原菌菌體生物質(zhì)膜功能受損，進(jìn)一步會(huì)引起病原菌細(xì)胞功能紊亂[9]，最終導(dǎo)致其活力降低，侵染活性也隨之下降。

植物細(xì)胞壁是防止病原菌入侵的天然屏障，這種天然屏障需要有專門(mén)的酶類來(lái)降解[10]。當(dāng)病原菌與植物相互作用時(shí)，在細(xì)胞壁組分的誘導(dǎo)下，產(chǎn)生一些與細(xì)胞壁降解有關(guān)的酶類，它們?cè)谇秩炯闹髦虏〉倪^(guò)程中起到至關(guān)重要的作用[11]。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，纖維素酶和β-D- 葡萄糖苷酶活性水平的高低與尖孢鐮刀菌的侵染力強(qiáng)弱呈現(xiàn)一定程度的關(guān)聯(lián)[10]，而且β-D- 葡萄糖苷酶活性越高，則分解細(xì)胞壁的速度會(huì)越快[12]。本研究表明，萬(wàn)壽菊殺菌素水乳劑可以降低纖維素酶和β-D- 葡萄糖苷酶活性，且隨著萬(wàn)壽菊殺菌素水乳劑添加量的增加，這2 類酶活性的降低越明顯。說(shuō)明萬(wàn)壽菊殺菌素水乳劑可通過(guò)降低細(xì)胞壁降解酶類的活性而降低尖孢鐮刀菌的侵染活性。

總之，萬(wàn)壽菊殺菌素水乳劑能夠通過(guò)對(duì)尖孢鐮刀菌膜透性的影響以及對(duì)植物與病原菌相互作用產(chǎn)生降解細(xì)胞壁酶類的影響，使尖孢鐮刀菌侵染活性下降，從而起到抑菌和保護(hù)植物的作用。

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