熒光定量PCR方法檢測腦脊液中結核分枝桿菌DNA的意義

崔中鋒 史繼靜

河南省傳染病醫院 鄭州 450000

本文應用熒光定量PCR 方法與抗酸染色、改良羅氏培養法進行比較，以評價熒光定量PCR 在結核分枝桿菌檢測中的臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 標本來源 河南省傳染病醫院2010-2011-08的住院病人。結核性腦膜炎組：根據病人臨床癥狀、體征、腦脊液的常規及生化（參照結核性腦膜炎的診斷標準）［1］、頭顱CT 等診斷為結腦，并經抗結核病治療有效者136例。其中兒童64例，男性48 例，女 性16 例。年 齡3 個 月～14 歲，平 均4.5歲；成人72例，男性30例，女性42例，年齡15～75歲，平均35.8歲。非結核性腦膜炎組（以下簡稱非結腦組）：64例。

1.2 主要儀器及試劑 抗酸染色采用貝索熱染法染色液，改良羅氏培養采用BD 9600儀器，實時熒光定量PCR 擴增儀器采用德國羅氏公司Light icycler 480；熒光定量PCR 方法檢測TB-DNA 試劑購自中山大學達安基因股份有限公司。

1.3 方法 采用熒光定量PCR 方法檢測結核性腦膜炎組和非結核性腦膜炎組的腦脊液中TB-DNA，按試劑盒要求取5.0×103拷貝／mL 為臨界值。結腦組同時進行抗酸染色及改良羅氏培養方法檢測結核桿菌。

2 結果

結腦組和非結腦組應用熒光定量PCR 方法、抗酸染色、改良羅氏培養檢測腦脊液中結核桿菌陽性率分別為59.56%、3.68%和7.8%。見表1。

表1 2組腦脊液標本檢驗陽性結果

為進一步證明熒光定量PCR 方法檢測腦液中結核桿菌對結腦診斷的優勢，對一部分病例間隔一段時間后，再次檢測1～2次。檢驗有1次為陽性即做為陽性患者。經熒光定量PCR 方法檢測結腦組不同次數的結果，分別為一次陽性率60.3%，2次陽性率85.4%，3次陽性率87.5%；第1次檢測值最大6.3×106拷貝／mL，最小4.1×102拷貝／mL，平均5.34×104拷貝／mL，經抗結核治療3周病情好轉；第2次檢測值最大8.1×105拷貝／mL，最小6.1×102拷／mL，平均為3.15×103拷貝／mL。這表明采用實時熒光定量PCR 方法檢測TB-DNA，通過定量值的變化，能夠做結核桿菌病原菌感染的早期診斷依據，還可觀察療效。

3 討論

結腦是結核分枝桿菌引起的以腦膜炎為主的非化膿性炎癥，是最常見的嚴重肺外結核病。由于結腦患者的腦脊液做結核桿菌抗酸染色和改良羅氏培養陽性率較低，因而給臨床結腦的病原菌診斷帶來很大困難。因此，應用熒光定量PCR 方法檢測腦脊液中結核菌是較為理想的方法［2］，對結核性腦膜炎的診斷有決定性意義。我院采用PCR 熒光定量方法檢測腦脊液結核桿菌的陽性率為59.56%，與廖錦良等［3］報道的57.3%與報道的53.5%、馮恩航等報道的57.4%較接近［4］。我院對同例應用熒光定量PCR 方法檢測2次陽性率可達到85.4%，檢測3次陽性率可達到87.5%，可見增加檢測次數可增加腦脊液中結核分枝桿菌的檢出陽性率；而應用熒光定量PCR 方法檢測非結腦組腦脊液結核桿菌的陽性率為0，說明該方法具有很好的特異性。因而，應用PCR 熒光定量檢測結果可比較準確地指示患者腦脊液中結核桿菌的多寡，不但有較高的陽性率，而且還具有很好的特異性和敏感性，對結核性腦膜炎不但可做病原菌診斷依據，而且還有助于指導患者臨床用藥和進行療效評估，對臨床具有很好指導意義。因此，當患者有結核性腦膜炎的臨床表現，如發熱、顱內感染癥時，早期、多次的進行腦脊液TB-DNA 的定量檢測是必須的。

［1］彭衛生，王英年，肖成志.新編結核病學［M］／／孔凡元.神經系統結核病.北京：中國醫藥科技出版社，1994：203-216.

［2］Tang YW，Procop GW，Persing DH.Molecular diagnostics of infectious diseases［J］.Clin Chem，1997，43（18）：2 021-2 038.

［3］廖錦良，譚耀駒，陳志成，等.Amplisensor-聚合酶反應定量檢測腦脊液中結核分枝桿茵DNA 的研究［J］.中國防癆雜志，2001，23（4）：245-247.

［4］馮恩航，王冬梅，楊文碧，等.熒光定量PCR 方法檢測腦脊液中結核茵DNA 的臨床意義［J］，黑龍江醫學，2011，35（4）：281-282.