磁性氧化鐵納米顆粒——通向腫瘤磁共振分子影像的重要基石

喬瑞瑞 曾劍峰 賈巧娟 杜 軍 沈 琳 高明遠,*

(1中國科學院化學研究所,北京100190;2中山大學藥學院,微生物與生化藥學實驗室,廣州510080; 3北京大學臨床腫瘤學院,北京腫瘤醫院,北京100036)

磁性氧化鐵納米顆粒
——通向腫瘤磁共振分子影像的重要基石

喬瑞瑞1曾劍峰1賈巧娟1杜 軍2沈 琳3高明遠1,*

(1中國科學院化學研究所,北京100190;2中山大學藥學院,微生物與生化藥學實驗室,廣州510080;3北京大學臨床腫瘤學院,北京腫瘤醫院,北京100036)

本文根據近年來國內外發表的相關研究成果,總結了磁性氧化鐵納米晶體制備方面的研究進展,并以磁性氧化鐵納米顆粒在腫瘤磁共振分子影像領域中的應用為背景,闡述了腫瘤分子影像領域的未來發展趨勢.

磁性納米顆粒;腫瘤;磁共振;分子影像;多模態

1 引言

目前,惡性腫瘤在許多國家位列居民死因順位的第一或第二位.世界衛生組織2011年最新的統計結果顯示,到2020年前,全球癌癥發病率將增加50%,即每年將增加1500萬癌癥患者.不僅如此,癌癥的死亡人數也在迅猛上升,至2030年,全球死于癌癥的人數將繼續增加74%,而且,全球20%的新發癌癥病人在中國,24%的癌癥死亡病人在中國.1

由此可見,惡性腫瘤已經成為導致人類死亡的主要疾病之一,但目前仍然缺乏針對腫瘤早期診斷、轉移預警、療效預測及有效治療的臨床方法.歸根結底,腫瘤的臨床診療不僅需要建立微小腫瘤的早期診斷手段,還亟需發展獲取分子及生理層面個體化信息的相關技術方法.從理論上講,近年來發展的分子影像技術不僅有希望以安全無創的方式,為微小腫瘤提供準確的空間定位信息,還可以為與腫瘤轉移、多藥耐藥及療效預測提供密切相關的個體化分子信息.目前,腫瘤分子影像技術的發展仍然強烈地取決于分子影像探針技術的發展,而磁性氧化鐵納米顆粒以其獨特的物理性質及良好的生物安全性,不僅可以用作靈敏度更高的磁共振造影劑,還為多功能、智能化腫瘤磁共振分子影像探針的構建提供了一個良好的材料平臺.近年來,隨著納米顆粒制備技術的飛速發展,圍繞磁性氧化鐵納米顆粒構建的腫瘤分子影像探針及相關腫瘤成像已經成為腫瘤分子影像研究的重要熱點.

2 腫瘤臨床診療的現狀與發展趨勢

實際上,截止本世紀初,幾十年的巨額資金投入并沒有實質性地降低癌癥患者的死亡率.例如:美國的癌癥死亡人數占總人口數量的比例在1950年是1.939‰,而2001年是1.940‰.

癌癥早期發現、早期診斷決定著其臨床治療的效果以及患者的預后.在大多數臨床病例中,I期癌癥患者的5年生存率＞90%.2在更早期(癌變前期)發現癌癥的患者通常可以被治愈.然而惡性腫瘤通常起病隱匿,早期多無明顯臨床表現.一旦出現臨床癥狀,大多已屬中、晚期,難以根治.惡性腫瘤的臨床診斷目前主要依賴于生物學檢測及醫學影像學方法.采用免疫學檢測技術、PCR(polymerase chain reaction)技術、基因芯片、蛋白芯片等生物學檢測方法,盡管可以檢測到微小腫瘤的特征性蛋白、酶、癌基因的變化,但仍然面臨以下實際問題:(1)采用生物學檢測方法可以實現血清相關腫瘤標志物的檢測,但無法對腫瘤進行定位;(2)目前廣泛采用的針對甲胎蛋白(AFP)、前列腺癌特異性抗原(TPSA)及癌胚抗原(CEA)的檢測方法僅作為腫瘤初篩方法,尚不能成為確診指標;(3)腫瘤活體組織檢查需通過創傷性手段,且獲得的組織量少,存在局限性.同時,目前所采用的常規影像手段仍然難以對直徑小于0.5 cm的微小腫瘤及轉移灶進行定位成像.

實現惡性腫瘤轉移的預警是提高患者生存率、改善生活質量的關鍵措施.惡性腫瘤的致命之處就在于腫瘤細胞具有很強的轉移遷徙和侵襲能力,一旦癌細胞從其原發部位向其他部位擴散,治療成功的希望就十分渺茫.目前嚴重缺乏對腫瘤發生、發展、轉移進行實時監控的有效手段,臨床所采用的腫瘤轉移檢查主要依賴于定期的常規腫瘤標志物檢測以及影像學檢查.然而,當臨床上診斷為復發和轉移時,病人通常都有了較明顯的癥狀和體征,對治療的耐受性明顯降低,從而使治愈率大大降低.從本質上講,腫瘤的發生發展與其惡性生物學行為密切相關,包括腫瘤的增殖、侵襲、轉移和耐藥等,這些惡性生物學行為往往是多種細胞內外重要分子事件共同作用的結果.盡管采用磁共振波譜和核醫學成像等手段可以在一定范圍內獲得有限的組織代謝信息,然而它們目前還不足以用于獲取與腫瘤惡性生物學行為密切相關的分子信息.

由此可見,惡性腫瘤的早期診斷,以及在轉移和耐藥等腫瘤惡性生物學行為中扮演主導角色的相關分子事件,是惡性腫瘤研究面臨的最基本的科學問題,同時也是腫瘤臨床診療所面臨的最重要的難題.發展具有先進功能的納米分子影像探針,以安全無創和原位實時的方式建立針對腫瘤早期診斷的分子影像技術,發展與惡性腫瘤轉移預警及療效預測相關的動態可視化方法,符合腫瘤個體化治療這一腫瘤診療的終極目標,是腫瘤臨床診斷的必然發展趨勢.

3 分子影像的現狀與發展趨勢

3.1 醫學影像技術

德國科學家倫琴1895年發現了X射線并成功獲得了其夫人手骨的照片,見圖1.這一事件標志著人類在無創的模式下可以實現對人體解剖結構的觀察,從而開啟了醫學影像學研究的先河.

圖1 X-ray發明人德國科學家倫琴于1895年12月22日制作的人類歷史上第一幅人體X光照片,該照片顯示了倫琴夫人左手的內部骨骼Fig.1 Hand mit Ringen(print of Wilhelm R?ntgen?s first“medical”X-rays of his wife?s left hand taken on 22 December 1895)

截止上世紀80年代,目前臨床采用的主要影像學手段已經全部確立,包括:核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)技術、X射線計算機斷層成像(X-ray computed tomography,CT)技術、核醫學成像技術(positron emission tomography,PET; single photon emission CT,SPECT)及超聲(ultrasound)成像技術等.而近15年上述影像技術又得到了一定的發展,比如先后出現了介入超聲(interventional ultrasound)技術、基于多層CT(multislice CT)的三維成像技術及磁共振彌散成像(diffusion MRI)技術等.在過去幾年,又出現了多模態影像聯用的設備,如: PET/SPECT-CT和PET-MRI,同時小型化動物實驗專用設備大量涌現.3

與上述臨床影像技術相比,光學影像技術在經歷了漫長的發展歷程后,在過去短短的20年得到了突飛猛進的發展,科學家已經成功地將各種先進的光學手段應用于醫學影像學研究中,并建立了多種先進的光學影像方法,包括:熒光反射成像(fluorescence reflectance imaging,FRI)、高分辨率生物發光成像(high-resolution bioluminescence imaging, HR-BLI)、時間分辨BLI、擴散光學層析成像(diffuse optical tomography,DOT)、熒光介導層析成像(fluorescence-mediated tomography,FMT)、熒光蛋白光學層析成像(fluorescence protein tomography,FPT)、光學相干層析成像(optical coherence tomography, OCT)、光頻選區成像(optical frequency-domain imaging,OFDI)、共聚焦顯微成像(confocal microscopy)、多光子顯微成像(multiphoton microscopy)以及顯微內窺鏡技術(microendoscopy)等.3

3.2 分子影像技術

分子影像(molecular imaging)技術即以非入侵的方式為活體內參與生理和病理過程的分子、病灶的關鍵靶位及宿主反應進行高靈敏度及特異性成像的方法.分子影像可在解剖形態基礎上更為深入地揭示組織細胞的生物學特點,如代謝、增殖、血管生成以及基因表達等.上述生物學信息更接近生命本質,因此不僅有助于提高腫瘤早期診斷的準確率,而且可以在分子水平上為腫瘤轉移預警及療效預測等提供必要的臨床依據.

分子影像技術所依托的成像手段既包括臨床上廣泛采用的影像技術,同時也包括目前正在高速發展的各種光學成像手段.

臨床常用影像技術的基本特征包括:(1)診斷深度無限制;(2)可以實現定量.但各種方法又存在各自的局限性,核醫學影像方法雖然具有更高的靈敏度,但空間分辨率較低.CT與MRI具有更高的空間分辨率,但敏感性尚需進一步提高.

光學成像技術的缺點包括組織穿透力受限、空間分辨率低及定量難度大等.針對這些缺點,目前在影像儀器方面出現了多種多模態成像技術,包括:FMT-MRI、FMT-CT等,以彌補光學影像的不足.盡管上述光學影像技術的臨床應用還有漫長的路要走,但光學影像可原位實時地在分子層面上揭示分子生物學過程的特點,有著目前臨床影像技術所不具備的優勢.

總之,將傳統的醫學影像技術和新近發展的光學成像方法應用于分子影像,不僅需要更新傳統的成像技術,有針對性地發展相關成像設備與成像方法,同時迫切需要發展建立分子影像探針的構建原理和構建方法.而納米分子影像探針以其獨特的優勢,在分子影像探針的構建方面體現出不可替代的優勢.首先,納米探針以其獨特的尺寸,在經合適的修飾后可表現出較常規小分子探針更長的血液循環時間,這使得納米探針能夠有更多機會與靶點相結合,以利于提高對感興趣區域的成像靈敏度.其次,納米探針以其表面多結合位點的結構特點,可選擇加載各種模態的成像探針分子以實現多模態分子影像探針的構建.最后,將納米技術與生物技術相結合還完全有可能構建出對靶點具有智能響應的新一代智能化分子影像探針(target-triggering smart probes).

4 納米醫學的現狀與發展趨勢

納米分子影像探針研究屬于“納米醫學”這個嶄新的研究領域.納米醫學既可廣義地定義為一種基于分子工具和醫學知識形成的臨床診斷和治療技術,也可以定義為利用納米尺度或納米結構材料具有的獨特的生物效應來發展其醫學應用的科學.4

納米醫學提出于上世紀90年代末期,但相關工作始于上個世紀80年代,當時與納米醫學最為密切相關的研究領域就是磁性氧化鐵納米顆粒在腫瘤診斷方面的應用及其臨床評估.標準的毒理藥理學測試結果表明磁性氧化鐵納米顆粒可以安全地用于人體,5早期研究結果表明靜脈注射的氧化鐵經分解后會被用于形成血紅蛋白、鐵蛋白及轉鐵蛋白.5,6在大量的臨床數據基礎之上,1996年美國食品藥物管理局(U.S.Food and Drug Administration,FDA)率先通過了兩種基于磁性氧化鐵納米材料的藥物,其中一種為口服類腹腔腸道磁共振造影劑(MRI contrast agent)藥物Ferumoxsil,其商品名稱為Gastro MARK?,在歐洲又被稱為Lumirem?,其主要成分為SiO2修飾的非化學計量比磁性氧化鐵納米顆粒.另一種為靜脈注射劑型的具有器官特異性(organspecific)的造影劑藥物Ferumoxide,其商品名為Feridex?,在歐洲又被稱為Endorem?.Feridex?的主要成分是右旋糖苷(dextran)修飾的非化學計量比磁性氧化鐵納米顆粒,其血液半衰期為2.4 h,清除時間為25 h.隨后,又出現了血液循環時間更長的造影劑藥物Ferumoxtran-10,其商品名為Combidex?,在歐洲又被稱為Sinerem?.Combidex?的主要成分是低分子量dextran修飾的非計量磁性氧化鐵納米顆粒,與Feridex?相比,Combidex?表現出更長的血液循環時間,在人體內的血液半衰期長達25-30 h.目前,上述造影劑藥物已經形成了近10種處于不同臨床實驗階段的產品.7

迄今為止,基于磁性氧化鐵納米顆粒的磁共振造影劑是人工合成納米材料在疾病診斷中得到實際應用的最為成功的案例.按照納米顆粒的流體力學尺寸,商品化的磁性氧化鐵納米顆粒造影劑可粗略地分為SPIO(small particle of iron oxide)和USPIO(ultrasmall particle of iron oxide)兩種類型.其中,Feridex?是SPIO類造影劑的典型代表,而Combidex?是USPIO類造影劑的典型代表.這種按照流體力學尺寸對磁性氧化鐵納米顆粒造影劑的劃分較為粗略,其邊界尺寸也較為模糊,一般認為在40-50 nm.

Feridex?經靜脈注射后,很快會被分布到肝、脾及骨髓等吞噬細胞豐富的網狀內皮系統(reticuloendothelial system,RES),因而在臨床上被廣泛用于肝部損傷的臨床診斷及良惡性腫瘤的鑒別診斷.

Combidex?由于具有更長的血液循環時間,經靜脈注射后會有部分從血液系統進入淋巴系統.臨床數據表明,該類USPIO造影劑可以成功地用于腫瘤的淋巴結轉移診斷,進而擴大了磁性氧化鐵納米造影劑在腫瘤早期診斷中的應用范圍.8

得益于最近10年發展起來的磁性納米晶體最先進的制備方法——磁性納米晶體的熱分解制備技術,在2005-2006年,Cheon團隊和Gao團隊分別在《Journal of the American Chemical Society》和《Advanced Materials》上率先報導了抗體靶向的磁性納米顆粒在荷瘤鼠模型上的惡性腫瘤診斷.9,10利用USPIO型造影劑具有更長血液循環時間的特點,通過共價耦聯腫瘤特異性識別抗體,得到了可以對腫瘤進行活體生物靶向的磁共振分子影像探針.這兩個獨立完成的研究工作證明了磁性氧化鐵納米顆粒的體內應用,除了通過RES系統攝取磁性氧化鐵納米造影劑這一被動靶向模式(passive targeting)之外,還可以利用納米材料表面耦聯的腫瘤靶向分子與腫瘤靶點的特異性結合實現對腫瘤病灶的主動靶向(active targeting),從而催生并推動了腫瘤的磁共振分子影像方法的建立和發展.同時上述工作也引領了納米材料生物體內應用的發展趨勢.

目前,納米材料的體內應用正從磁性氧化鐵納米顆粒快速向包括貴金屬納米顆粒、納米碳管、富勒烯、量子點等材料體系拓展.11-14而應用方向則從單一的成像向治療(腫瘤的熱治療)及成像和藥物治療相結合的方向拓展.15,16實際上,納米材料的體內應用一直面臨著安全性的質疑.雖然磁性氧化鐵的體內安全性已經得到了廣泛的評估,但其它被用于體內應用研究的納米材料,如貴金屬納米顆粒、納米碳管和量子點等尚缺乏完整全面的臨床評估.盡管如此,不可否認的是與小分子相比,納米材料以其特殊的尺寸效應在體內應用方面已經展示出獨特的應用價值.7,17

總之,納米醫學是腫瘤深入研究的必經之路.納米醫學研究的內涵不僅包括納米材料及納米智能結構在疾病臨床診療中的應用,同時也包括如何利用納米材料及納米智能結構的獨特性質,在分子層面揭示疾病的發生發展過程的相關機制.

5 基于磁性氧化鐵納米顆粒的磁共振造影劑

5.1 磁性氧化鐵納米顆粒的磁共振造影劑的現狀與發展趨勢

在眾多醫學影像手段中,MRI具有更高的人體安全性,2009年IBM公司和美國斯坦福大學合作已經將核磁共振成像分辨率提高到10 nm以內.18這一最新研究成果表明以核磁共振為核心,進一步發展腫瘤的分子影像技術方法具有積極的意義.

MRI具有安全、無創、高空間分辨率、多方位及多參數成像等特點,同時所獲得的解剖信息不受組織深度影響,MRI已經成為目前臨床診斷中不可或缺的重要成像手段之一.同時,由于MRI能夠實現高分辨率的軟組織成像,因此有望作為分子影像的重要成像手段用于腫瘤的早期鑒別診斷.然而,由于MRI存在敏感性低的缺點,所以用于提高病灶與健康組織之間成像對比度的MRI造影劑在臨床診斷應用中變得不可或缺.以醫學科學院腫瘤醫院為例,據不完全統計50%以上的患者在接受磁共振造影檢測前需要注射造影劑.

目前,常見的MRI造影劑主要分為兩類,即順磁性造影劑和超順性造影劑.其中順磁性造影劑可實現T1加權像的對比增強,因此又被成為T1造影劑.T1造影劑主要采用順磁類金屬離子,如Gd(III)、Mn(II)和Fe(III)等,但臨床應用最為廣泛的是Gd的有機金屬配合物,如Gd-DTPA(diethylene triamine pentacetate acid,DTPA)在臨床上被廣泛用于血管造影,因此又被稱為血池造影劑.正常情況下,Gd配合物造影劑不能通過血腦屏障(blood-brain-barrier, BBB),但是由于腫瘤血管通透性增加,因此Gd配合物造影劑可以用于腦腫瘤造影.Gd-DTPA的臨床注射計量為0.1-0.3 mmol·kg-1BW(body weight),血液半衰期為90 min左右,24 h的體內清除率在90%以上,19主要清除途徑是腎臟.溶液中自由的Gd離子具有非常高的毒性,但與有機配體結合后,其毒性大大降低.最近美國FDA已發布關于含Gd類造影劑的公共衛生警告,警告Gd類造影劑可能導致腎源性纖維化/腎源性纖維皮膚病(nephrogenic systemic fibrosis/nephrogenic fibrosing dermopathy).

與順磁性Gd配合物類造影劑不同,超順磁性造影劑有更好的T2加權成像的對比增強效果,因此超順磁性造影劑又被成為T2造影劑,鑒于已經有很多關于磁性納米晶體增強MRI對比度原理方面的文獻報導,20在此不再贅述.目前的T2造影劑主要以磁性氧化鐵納米顆粒為主,與Gd類小分子造影劑相比,以磁性氧化鐵納米顆粒為核心的納米造影劑的檢測靈敏度要顯著高于Gd類造影劑,7比如Gd有機配合類造影劑在體外的檢測靈敏度為10-4-10-5

mol·L-1,21而磁性氧化鐵納米顆粒造影劑的檢測靈敏度可達10-9mol·L-1.22,23因此,磁性氧化鐵納米顆粒以其優異的體內安全性、腫瘤組織特異性及高磁敏感性,已經成為構建新型MRI造影劑的首選材料.

盡管Advanced Magnetics(后更名為AMAG Pharmaceuticals)推出的Feridex?和Combidex?磁共振造影劑在臨床研究與應用中取得了巨大的成功,最近AMAG Pharmaceuticals決定停產FDA已經批準上市的Feridex?和始終沒有獲得FDA批準上市的Combidex?,只保留了GastroMARK?和另外一種處于三期臨床(Phase III clinical trial)的靜脈注射藥物Ferumoxytol,其商品名稱為Feraheme?.Feraheme?的主要成分是葡萄糖山梨酸羧甲基醚縮聚物(polyglucose sorbitol carboxylmethyl ether)修飾的非化學計量比磁性氧化鐵納米顆粒,它既可以用于治療成人慢性腎病引起的缺鐵性貧血,又可以用于MR造影.一直得到高度關注并在歐洲取得臨床應用的Combidex?被迫停產的原因頗為復雜,其中腫瘤淋巴轉移的臨床診斷效率尚需提高是其中的一個主要的原因.24由此可見,早期商品化的磁性氧化鐵納米顆粒制劑并不能完全滿足臨床診斷的實際需求,尤其是更為困難的腫瘤診斷.因此,不論是從事腫瘤MRI造影劑臨床應用的醫生還是腫瘤疾病患者都在呼喚著新一代磁性氧化鐵納米顆粒腫瘤MRI造影劑.在這一臨床需求的推動下,近年來關于磁性氧化鐵納米顆粒的合成與造影劑應用研究呈高速發展趨勢.同時基于新型磁性氧化鐵納米顆粒的各種相關科研產品層出不窮,其中Oneder-Hightech發展的新型造影劑產品已經得到了廣泛的應用.

5.2 磁性納米晶體的合成

目前臨床用商品化的磁性納米顆粒造影劑均是采用共沉淀法制備的.共沉淀方法的原理是通過化學計量比的二價和三價鐵離子在特定pH值及穩定劑存在的情況下,通過水解、陳化反應來實現磁性氧化鐵納米顆粒制備的.共沉淀方法盡管可以在嚴格的條件下實現一定尺寸磁性納米顆粒的制備,25但仍然存在一些不可避免的缺點.首先,鐵離子的水解反應為多級反應,動力學控制參數多,不利于對顆粒尺寸,尤其是尺寸分布的調控.其次,共沉淀反應的介質“水”作為強極性溶劑以及OH-與三價鐵離子的強配位能力,使得氧化鐵納米顆粒的表面修飾變得非常復雜.再次,水作為強極性溶劑也會同時誘導納米顆粒表面某些晶面體現出優勢生長趨勢,進而使得到的顆粒形狀趨于不規則.最后,溶劑水以其有限的沸點溫度,也不利于獲得高結晶度的磁性氧化鐵納米顆粒.

得益于納米顆粒的高溫熱分解制備技術,上述諸多顆粒合成所面臨的缺陷得以克服.高溫熱分解反應的反應介質為高沸點的非極性或弱極性溶劑,從化學合成原理上講,高溫熱分解方法摒棄了鐵離子的水解反應,轉而通過有機鐵鹽或有機鐵配合物的熱分解來實現磁性納米晶體的制備.盡管鐵前驅體的熱分解反應非常復雜,但更高的反應溫度有利于大大提高產物的結晶度,從而進一步提高了磁性氧化鐵納米顆粒的磁響應特性.而無水參與的熱解反應不僅有利于實現納米晶體表面修飾的多樣性,同時也有利于獲得窄粒度分布的磁性納米晶體.總而言之,相對于在水體系中制備的納米顆粒,通過熱分解反應在非水體系中制備得到的磁性氧化鐵納米顆粒具有更好的磁響應性及更窄的粒度分布.本文將在非水體系中通過熱分解鐵前驅體的方式制備得到的高結晶度、窄粒度分布的磁性氧化鐵納米晶體,稱為新型氧化鐵納米顆粒.

1999年,Alivisatos團隊26率先報導了利用熱分解制備技術合成的γ-Fe2O3磁性納米晶體.實驗中,他們通過直接向300°C的三辛胺溶劑中注射FeCup3(Cup:C6H5N(NO)O-)三辛胺溶液方法(熱注射法, hot-injection method),制備得到了平均尺寸為(10.0± 1.5)nm的γ-Fe2O3磁性納米晶體,見圖2(a).由圖可見,利用熱分解方法得到的納米晶體,其形貌清晰,且粒度分布寬度遠遠小于利用共沉淀方法得到的納米顆粒的粒度分布寬度.因此,該研究工作一經報導,便得到高度關注,旋即掀起了高質量磁性氧化鐵納米晶體制備研究的熱潮.

稍后,Hyeon團隊27改進了上述合成方法,選用Fe(CO)5作為反應原料,以熱注射方法制備得到了單分散的γ-Fe2O3納米晶體,見圖2(b).通過改變Fe(CO)5及作為穩定劑的油酸之間的比例,實現了顆粒尺寸在4-11 nm范圍內的調控.同時進一步利用種子生長方法,得到了尺寸為16 nm的γ-Fe2O3納米晶體.

2002年,Sun團隊28以乙酰丙酮鐵(Fe(acac)3)為鐵前驅體,油酸、油胺為穩定劑,1,2-十六醇為還原劑,在高沸點溶劑苯醚中,通過加熱法(heating-up method),即直接加熱含有所有反應物的溶液到指定溫度,成功地合成了4 nm的球形Fe3O4納米晶體,并以此為晶種,通過種子生長方法制得了20 nm的球形Fe3O4納米晶體(圖2(c)).采用類似的方法,Sun團隊29隨后還合成了一系列單分散的MFe2O4(M= Fe,Mn,Co)磁性納米晶體.

圖2 通過熱分解不同種類的前驅體制備得到的磁性氧化鐵納米晶體的透射電鏡(TEM)照片Fig.2 Transmission electron microscope(TEM)images of magnetic nanocrystals prepared by pyrolyzing various types of iron precursors(a)γ-Fe2O3nanocrystals synthesized by pyrolyzing FeCup3;(b)γ-Fe2O3nanocrystals synthesized by pyrolyzing Fe(CO)5;(c)Fe3O4nanocrystals prepared by pyrolyzing Fe(acac)3;(d)magnetic iron oxide nanocrystals prepared by using iron oleate as precursor. Images a,b,c and d are reprinted from Refs.26,27,28,and 30,respectively,with permissions.

2004年,同樣采用加熱法,Peng團隊30報導了一種簡便的制備過渡金屬氧化物納米晶體的合成路線,他們通過采用分解脂肪酸鐵鹽的方式,實現了窄粒度分布的磁性Fe3O4納米晶體的制備.同時發現,脂肪酸的長度對納米晶體的尺寸有著重要的調控作用.幾乎同時,Hyeon團隊31采用油酸鈉與FeCl3·6H2O的反應先制備了油酸鐵,然后直接加熱油酸鐵的十八烯溶液,在320°C下經30 min反應制備得到了10 g級高結晶度、單分散的磁性氧化鐵納米晶體(圖2(d)).通過控制反應溫度,還得到了不同尺寸的納米顆粒,例如274、287、317、330、365°C條件下分別得到了5、9、12、16及22 nm的氧化鐵納米晶體.這一大規模制備方法的建立,極大地鼓舞了人們進一步探索高質量磁性納米晶體的應用.

2007年,Cheon團隊32報導了MFe2O4(M=Mn, Fe,Co,Ni)鐵氧體納米晶體的制備,研究了摻雜M離子對所得到的磁性納米晶體磁學性質的影響,并得到了較Fe3O4具有更高飽和磁化強度的油酸、油胺共修飾的MnFe2O4納米晶體.經表面配體置換后,獲得的12 nm的水溶性MnFe2O4的摩爾弛豫率高達358 mmol-1·L·s-1,較相同尺寸的Fe3O4表現出更好的磁共振造影增強效果.而針對相同合成路線制備的新型磁性氧化鐵納米晶體,其顆粒的尺寸越大,飽和磁化強度越強(圖3),橫向弛豫時間/有效弛豫時間(T2/T2*)加權像的對比增強效果也越顯著.33然而,磁性氧化鐵納米晶體的磁化強度及其摩爾磁化率不僅與顆粒尺寸相關,還與納米顆粒的表面修飾結構及合成方法密切相關,部分文獻統計結果見表1.32-37由表1數據可以看出,采用熱分解方法制備的新型磁性氧化鐵納米晶體較采用共沉淀方法制備的磁性氧化鐵納米晶體表現出更高的摩爾弛豫率,因此勢必表現出更好的磁共振造影增強效果.

圖3 Fe3O4納米顆粒磁學性質的尺寸依賴性質33Fig.3 Size dependent magnetic properties of Fe3O4 nanoparticle33(a)hysteresis loops,mass magnetization values at 1.5 T,and TEM images;(b)plot of Ms1/3vs r-1.The Fe3O4nanoparticles were prepared by thermal decomposition of Fe(acac)3,then dissolved in water upon ligand exchange process by replacing the hydrophobic ligand with hydrophilic dimercaptosuccinic acid(DMSA).

總之,利用上述高溫熱分解制備方法所得到的磁性氧化鐵納米晶體,較采用傳統水解方法得到的納米晶體表現出如下優勢:(1)結晶度更高、磁響應性更強;(2)納米晶體的單分散性更好;(3)表面修飾結構更為清晰.因此,高溫熱分解方法以其上述產品優勢正在掀起新型磁性納米顆粒在磁共振分子影像技術中應用的新一輪研究熱潮.9,10,32,38,39

表1 文獻中報導的磁性納米顆粒造影劑的一些基本數據對比Table 1 Properties of magnetic iron oxide particle-based contrast agents

5.3 新型磁性氧化鐵納米顆粒的表面修飾

盡管高溫熱分解方法在高質量磁性納米晶體的制備方面體現出獨特的優勢,但上述方法制備的磁性氧化鐵納米晶體表面均修飾有疏水性配體,如:油酸、油酸和油胺、或脂肪酸等,因而表現出油溶性,不能直接用作磁共振造影劑.因此表面配體置換方法及相轉移方法被分別用于實現上述高質量磁性納米晶體的水溶性,見圖4.

表面配體置換方法需要與鐵離子具有更強配位能力的水溶性配體來置換納米晶體表面修飾疏水性配體,進而實現納米晶體的水溶性.例如, Cheon團隊9采用2,3-二巰基丁二酸(DMSA)交換納米顆粒表面的疏水性配體制備出了可在水中及PBS中溶解并穩定的Fe3O4納米顆粒;Sun團隊38,40利用多巴胺與Fe的穩定螯合作用,通過對顆粒表面疏水性配體的置換得到了多巴胺包覆的Fe3O4納米顆粒同樣可以在水及PBS中形成穩定溶液.為了進一步提高Fe3O4納米顆粒的生物相容性,Hyeon團隊41采用聚乙二醇(PEG)氧磷衍生物(PEG-derivatized phosphine oxide,PO-PEG)取代顆粒表面的油酸分子,得到了PEG修飾的水溶性納米顆粒;利用帶有氨基的PO-PEG,得到了表面有氨基官能團的水溶性Fe3O4納米顆粒.除上述方法之外,最近Hyeon團隊42將疏水性Fe3O4納米顆粒與硫酸鈉混合,在500 °C加熱處理5 h,經除鹽后得到了能夠在水中分散的“裸”的納米顆粒,再加入Dextran衍生物作為表面配體,得到了Dextran包覆的Fe3O4納米顆粒.該納米顆粒可在pH 4-11及0.15 mol·L-1NaCl中穩定分散.總之,配體交換法的主要特點是得到的納米顆粒水合尺寸相對較小,但對配體置換效率及程度的控制較為困難.7

圖4 通過配體交換(a)或相轉移(b)方法將油溶性磁性氧化鐵納米顆粒轉換為水溶性顆粒的示意圖Fig.4 Schematic drawings for illustrating the strategies for converting hydrophobic particles to hydrophilic ones by ligand exchange(a)or by phase transferring process(b)

相比于表面配體置換方法,相轉移方法利用相轉移劑中的疏水鏈與顆粒表面修飾的疏水性配體間的疏水相互作用,來實現油溶性納米晶體向水介質中的轉移.例如,Robinson等43采用烷基膦酸酯(alkylphosphonate)類表面活性劑與乙氧基化脂肪醇或磷脂復配體系為相轉移劑,得到了水溶性的MFe2O4(M=Fe,Co,Mn)納米顆粒;Nitin等44合成了一種PEG磷脂衍生物(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-methoxy(polyethylene glycol) 2000,DSPE-mPEG 2000),并利用其將油溶性Fe3O4納米顆粒轉移到水相.含有長烷基鏈的接枝親水性聚合物大分子表面活性劑也常被用于實現油溶性納米顆粒向水相的轉移,如Pellgerino等45采用十四烯-馬來酸酐共聚物(poly(maleic anhydride-alt-1-tetradecene))成功將疏水性納米顆粒如Fe2O3,CoPt3, CdSe@ZnS及Au納米顆粒轉移至水相,得到了能夠在水中及TBE緩沖液(pH 8-9)中穩定分散的納米顆粒.采用類似的思路,Yu等46合成了兩親性的PEG 6000接枝的十八烯-馬來酸酐共聚物(poly(maleic anhydride-alt-1-octadecene),PMAO),采用該聚合物對疏水性Fe3O4納米顆粒進行包覆,得到的PMAO-PEG包覆的Fe3O4納米顆粒能夠在pH 4-10范圍內穩定分散,并能夠在10×PBS及1 mol·L-1NaCl中穩定2年以上.這些結果充分說明,采用大分子表面活性劑通過相轉移方法得到的水溶性納米顆粒,在水介質中能表現出更好的膠體穩定性.然而,磁性納米晶體對MR成像對比度的增強作用是通過改變氫質子弛豫過程來實現的,而上述作用強烈地依賴于氫質子與磁性納米晶體間的距離.鑒于磁偶極耦合常數與距離的三次方成反比,相轉移方法在顆粒周圍引入的疏水層有可能會降低磁性納米晶體的MR造影增強效果.此外,相轉移方法還將無謂地增加所得到的納米晶體的水合尺寸,進而影響納米晶體的體內分布行為及血液循環行為.

針對上述問題,高明遠團隊等以磁性納米晶體在MRI造影劑方面的應用為研究目標,進一步發展了高溫熱分解方法在水溶性及生物相容性磁性納米晶體制備方面的應用.2004年,Li等47首先報導了以高沸點的強極性溶劑(2-吡咯烷酮)來替代文獻中常用高沸點弱極性或非極性溶劑,通過熱分解Fe(acac)3,以“一鍋”反應制備了水溶性Fe3O4納米晶體(圖5).盡管所得到的磁性納米晶體不能直接分散于中性水中,但卻能在酸性或堿性溶液中很好地溶解分散.該技術路線的最大優勢是所采用的溶劑與諸多種類的表面配體均具有很好的相容性,為納米晶體表面配體的多樣化原位修飾提供了可能.此外,上述方法秉承了高溫熱解法在合成高質量磁性納米晶體方面體現出的獨特優勢,同時實現了磁性納米晶體的簡便制備.

圖5 采用2-吡咯烷酮作為溶劑通過“一鍋”反應制備的Fe3O4納米顆粒TEM照片47Fig.5 TEM images of magnetite nanoparticles prepared via“one-pot”reaction by using 2-pyrrolidone as solvent47The average particle size is 5 nm(a)and 11 nm(b). In the photo(b)a HRTEM image of a selected magnetic nanocrystal is inserted.

示意圖1 在2-吡咯烷酮中直接加熱FeCl3·6H2O制備Fe3O4納米晶體的機理48Scheme 1 Mechanism leading to the formation of Fe3O4nanocrystals by refluxing 2-pyrrolidone solution of FeCl3·6H2O48

2005年,Li等48又報導了在2-吡咯烷酮直接分解FeCl3·6H2O得到的不同尺寸Fe3O4納米晶體的方法,并探討了Fe3O4納米晶體的形成機理,見示意圖1.該技術路線提供了一個Fe3O4納米晶體的綠色合成方法,然而所得到的Fe3O4納米晶體表面同樣修飾有2-吡咯烷酮,因此只能分散于酸性或堿性水溶液中,而不能被溶解到中性水中.

圖6 在NVP中通過熱分解Fe(acac)3形成的PVP修飾的Fe3O4納米晶體在不同溶劑環境中形成的穩定的溶液(左)及其在外磁場(右)作用下的磁響應特性49Fig.6 Photographs of Fe3O4nanoparticles dispersed in different types of solvents taken in the absence(left)and presence (right)of a permanent magnet.The Fe3O4nanoparticles were prepared by thermal decomposition of Fe(acac)3in NVP49The“left”and“right”is relative to each group of sample. DMSO:dimethyl sulfoxide;DMF:dimethylformamide;PBS:phosphate buffered saline

針對這一問題,Lu等49在2008年報導了具有超級溶解性能的聚(N-乙烯基-2-吡咯烷酮)(PVP)修飾的Fe3O4納米晶體.在該納米晶體的合成中,2-吡咯烷酮被N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)替代.與2-吡咯烷酮相同的是,NVP同樣為高沸點配位溶劑,而不同的是NVP可以通過熱聚合形成PVP.這樣通過熱分解Fe(acac)3,經簡單“一鍋”反應即可得到具有超級溶解性能的磁性Fe3O4納米晶體.該反應的巧妙之處在于NVP不但充當了高溫傳熱介質,而且可通過原位聚合在納米顆粒表面形成PVP;而Fe(acac)3不僅充當了Fe3O4的前驅體,又可引發NVP自由基聚合,因此該反應巧妙地結合了Fe3O4納米晶體的高溫熱分解制備與表面聚合物原位修飾.所形成的PVP以部分鏈段與Fe3O4納米晶體表面進行配位,進而起到穩定劑的作用;而另一部分非配位的PVP鏈段則賦予了Fe3O4納米晶體超級溶解性能,使其不但能夠溶于不同pH值的水溶液中及PBS生理緩沖液中,而且能夠溶于多種有機溶劑并能形成穩定的膠體溶液,見圖6.49采用類似方法,通過同時分解Ni(acac)2和Fe(acac)3還可以得到PVP修飾的性質類似的鎳摻雜磁性氧化鐵納米晶體.50

圖7 利用“一鍋”反應制備的表面修飾有PEG的生物相容性Fe3O4納米顆粒51Fig.7 PEG modified biocompatible Fe3O4nanoparticles prepared by“one-pot”reaction51(a)TEM image,(b)electron diffraction patterns,(c)the histogram; PEG:polyethylene glycol

實際上,磁性氧化鐵納米晶體在MRI造影劑中的應用不僅僅需要磁性氧化鐵納米晶體具有水溶性,同時還要求其具有良好的生物相容性.針對這一問題,Li等51在2005年報導了利用“一鍋”反應制備技術合成的生物相容性磁性納米顆粒(圖7).在這個合成中,他們利用2-吡咯烷酮對不同種類表面配體的良好溶解性,通過在反應體系中加入生物相容性的羧基化PEG,在磁性氧化鐵納米顆粒形成的同時,原位地實現了磁性納米顆粒的表面生物相容性修飾.PEG修飾不僅大大地改善了Fe3O4納米顆粒的水溶性,同時有效地提高了Fe3O4納米顆粒的血液循環時間.更為最重要的是,PEG以其良好的親水性使環境中的水分子能更容易接近納米顆粒表面,因此PEG修飾的Fe3O4納米顆粒在相同條件下可表現出更為優異的MRI造影功能.392007年,他們報導了利用該技術制備的表面帶有羧基殘基的生物相容性磁性Fe3O4納米顆粒(圖8),52生物相容性納米顆粒表面的羧基殘基為進一步將磁性氧化鐵納米顆粒與生物大分子耦聯,進而獲得磁共振分子影像探針提供了可能.

2009年,Liu等39報導了在非極性溶劑中利用“一鍋”反應制備的生物相容性磁性納米晶體.在這一新型的Fe3O4納米顆粒的制備中,配位溶劑2-吡咯烷酮被非配位溶劑二苯醚取代,同時反應體系中引入了油胺,因此得到的磁性Fe3O4納米晶體表面具有PEG/油胺共修飾結構.與2-吡咯烷酮體系中得到的表面共修飾有PEG/2-吡咯烷酮的Fe3O4納米晶體相比,前者在PBS緩沖液及生理鹽水中表現出更好的膠體穩定性.39進一步動態光散射及等溫滴定量熱實驗結果表明PEG/油胺共修飾的Fe3O4納米晶體與血漿中高豐度蛋白-白蛋白和免疫球蛋白表現出較弱的相互作用,而PEG/2-吡咯烷酮共修飾的Fe3O4納米晶體由于靜電相互作用與白蛋白表現出很強的相互作用.這一研究結果為深入理解無機納米晶體表面修飾結構與性質對納米晶體體內分布的影響提供了重要的實驗支持.53

圖8 利用“一鍋”反應制備的表面具有可反應官能團的生物相容性Fe3O4納米顆粒的TEM照片52Fig.8 TEM images of biocompatible Fe3O4nanoparticles with surface reactive moieties52The average particle size is 12 nm(a)and 27 nm(b),respectively.

2011年,Jia等54在二苯醚反應體系中發現了異常的凝膠化現象,并利用油胺、雙羧基PEG及Fe(acac)3之間能形成凝膠的特點,通過對反應體系凝膠化程度的控制,首次實現了利用單一反應配方合成不同尺寸生物相容性磁性氧化鐵納米晶體的新方法,并在5.8-18.9 nm范圍內實現了對生物相容性納米晶體尺寸的有效調控,見圖9.這一研究成果為進一步推動磁性氧化鐵納米顆粒的體內應用,并深入揭示納米晶體尺寸對其磁共振造影效果、生物體內分布、腫瘤診斷效率等方面的影響奠定了重要的基礎.

總之,上述結果表明Gao團隊55發展的磁性氧化鐵納米顆粒的“一鍋”反應制備技術,一方面充分利用了高溫熱分解反應的優勢,另一方面巧妙地擺脫了納米顆粒水溶性及生物相容性修飾通常需要采用的后處理過程,因此為磁性納米顆粒的生物應用提供了更為便捷的合成路線.

6 磁性氧化鐵納米顆粒MRI造影劑在腫瘤診斷中的應用

6.1 生物相容性磁性氧化鐵納米顆粒作為造影劑在腫瘤診斷中的應用

磁性氧化鐵納米顆粒應用于腫瘤診斷應具備以下條件:

首先,磁性納米顆粒在MR造影及MR分子影像中的應用要求其在生理環境中表現出良好的自發溶解能力,并形成穩定的膠體溶液,從而保障納米材料在血液及淋巴系統循環過程中不會造成栓塞.納米顆粒在溶液中分散并形成穩定的膠體溶液需要納米顆粒間有足夠強的相互排斥作用,而這種作用強烈地依賴于納米顆粒的表面修飾.帶電顆粒間靜電排斥力可以幫助納米顆粒形成穩定的膠體溶液,然而依靠靜電斥力形成的膠體溶液在其它電解質存在的情況下容易發生聚沉.因此,針對生物體內應用,磁性氧化鐵納米顆粒通常采用聚合物來修飾,利用聚合物的空間位阻作用以獲得在生理環境中能夠穩定分散的磁性納米顆粒.7需要指出的是,表面為正電性或負電性的納米顆粒與生理條件下呈電中性的磁性納米顆粒相比,通常其血液循環時間均較短,這主要是因為納米顆粒與血漿中的調理素蛋白的靜電相互作用使其更容易被免疫系統清除所致.7

其次,良好的生物相容性,包括較低的毒性及清晰的代謝途徑是納米顆粒體內應用的必備條件.所謂材料的生物相容性是指該材料在發揮特定作用的同時不會給患者帶來局部或全身的副反應.56傳統上,生物相容性是研發長期發揮作用的植入型器件(implantable devices)所關心的問題.而磁性氧化鐵納米顆粒作為造影劑,由于在發揮造影作用后會被排出體外,因此其生物相容性修飾更多需要考慮的是修飾材料是否會帶來毒性、引起局部及全身反應,及對納米顆粒循環行為及代謝途徑的影響等.7目前的研究結果表明,具有適當分子量的Dextran和PEG是修飾磁性納米顆粒使其獲得生物相容性的最佳候選材料.

再次,與依賴于Kupffer細胞對納米材料吞噬的肝部腫瘤或結節造影不同的是,腫瘤診斷還可以通過多種不同機制實現造影劑在腫瘤部位的有效富集,但這需要磁性納米顆粒具備足夠長的血液循環時間,可以說長血液循環時間是磁性納米顆粒在腫瘤MR成像及MR分子影像中應用的重要前提.文獻結果表明,經Dextran或PEG修飾的磁性納米晶體,在合適尺寸的條件下,可以表現出長達10 h或更長的血液半衰期.眾所周知,在腫瘤發生發展過程中形成的腫瘤新生血管結構及功能異常,與正常組織血管相比,腫瘤組織血管豐富且血管壁間隙較寬,結構完整性差,淋巴回流缺失,使得腫瘤組織表現出特殊的高通透效應和高滯留效應(enhanced permeability and retention(EPR)effect).因此,具有長血液循環時間的Fe3O4納米顆粒在通過血液循環到達腫瘤部位后,可滲入腫瘤組織,從而能夠在腫瘤部位富集而實現T2造影增強效果(圖10).57

6.2 基于新型磁性氧化鐵納米顆粒的腫瘤磁共振分子影像

近些年來的研究表明,在腫瘤的發生發展的各個階段,腫瘤細胞膜表面常常會高表達某些特征分子,其中一些特征分子已經被證明可以作為標志物用于腫瘤的早期診斷.因此,將醫學影像學技術與探測腫瘤細胞表面的特異性分子標志物相結合,推動形成了高度特異的成像技術——腫瘤分子影像診斷技術.

而針對腫瘤細胞表面的腫瘤相關標志物的檢測,以磁性納米顆粒為核心構建相關分子影像探針還需要磁性氧化鐵納米顆粒表面具有可反應官能基團如－COOH,－NH2,琥珀酰亞胺等.通過這些可反應官能基團將腫瘤靶向分子通過共價鍵耦聯于納米顆粒表面,進而獲得可通過靶向分子與靶點間特異性識別作用進行腫瘤成像的分子影像探針.與被動靶向模式相比,基于主動靶向模式的腫瘤分子影像在腫瘤早期診斷與鑒別診斷方面表現出更大的技術優勢.

圖9 由“一鍋”反應制備得到的不同尺寸的生物相容性Fe3O4納米顆粒的TEM照片54Fig.9 TEM images of differently sized biocompatible Fe3O4nanoparticles prepared upon a single preparation recipe54

圖10 氧化鐵納米顆粒穿過高滲透性血管進入特定組織實現主動靶向的示意圖57Fig.10 Illustration of tissue specific delivery of iron oxide nanoparticles through active targeting facilitated by“leaky”vasculature57 Internalization of nanoparticles by receptor-mediated endocytosis and formation of an endosome. Endosomal acidification by proton pumps results in elevated osmotic pressure,swelling. rupture of the endosome allowing for release of the nanoparticle and conjugated therapeutic agents

圖11 以Herceptin標記的MnMEIO(MnFe2O4)納米顆粒與Herceptin標記的CLIO磁性納米顆粒為探針在小鼠體內檢測腫瘤的磁共振實驗結果32Fig.11 In vivo MR detection of tumor using MnFe2O4-Herceptin and CLIO-Herceptin conjugates as molecular probe,respectively32(a-f)Color maps of T2-weighted MR images of a mouse implanted with the cancer cell line NIH3T6.7,at different time points after injection of MnMEIO-Herceptin conjugates or CLIO-Herceptin conjugates(preinjection(a,d);and 1 h(b,e)or 2 h(c,f)after injection).In a-c,gradual color changes at the tumor site,from red(that is,low R2)to blue(that is,high R2),indicate progressive targeting by MnMEIO-Herceptin conjugates. In contrast,almost no change is seen in the mouse treated with CLIO-Herceptin conjugate(d-f).(g)Plot of R2 change versus time.In the mouse treated with MnMEIO-Herceptin conjugate(squares),significant R2 changes(up to 34%)were observed with time after treatment.In contrast, R2 changed by＜5%after treatment with CLIO-Herceptin conjugate(dots)and by＜13%after treatment with 12-nm-MEIO-Herceptin conjugate (triangles).(h)ex vivo MR images(i-iii)of explanted tumors(8 h)and their color maps(iv-vi).CLIO:cross-linked iron oxide

到目前為止,腫瘤活體分子影像基本上依賴于對腫瘤細胞膜蛋白特征分子的識別來實現的,通過磁性氧化鐵納米顆粒耦聯對這些特征分子具有特異性識別功能的靶向分子,如:抗體(包括全抗、基因工程單鏈抗體)、10,32多肽、38及葉酸等,58可得到對腫瘤部位進行靶向識別的MR分子影像探針.這種探針可通過EPR效應進入腫瘤組織,再通過其靶向分子與腫瘤細胞或腫瘤新生血管表面的受體的特異性結合而在腫瘤區域富集,達到對腫瘤的MR造影增強效果(見圖11).

韓國幾個研究團隊和高明遠團隊率先開展了基于新型磁性氧化鐵納米顆粒的腫瘤診斷研究. 2005年,Cheon等9報導了采用Herceptin標記的超順磁Fe3O4納米顆粒對小鼠體內乳腺癌腫瘤的活體檢測.在此基礎上,他們在2007年又進一步報導了Herceptin標記的錳摻雜氧化鐵顆粒MR分子影像探針,并證明該探針可實現約50 mg小腫瘤的活體檢測,32從而將活體腫瘤影像診斷的極限推向了一個新的高度.32圖11結果表明,Herceptin標記的MnFe2O4的造影效果(橫向弛豫率變化值(ΔR2)～34%)要遠遠優于同樣條件下制得的Fe3O4(ΔR2～13%)和采用共沉淀制備方法得到的CLIO(cross-linked iron oxide)型造影劑(ΔR2增強～5%).32

幾乎同時,Hu等10通過前面介紹的“一鍋”反應制備的PEG修飾的Fe3O4納米顆粒與人源化抗CEA單克隆抗體rch 24進行耦聯,得到了以癌細胞表面癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)為靶點的腫瘤MR分子影像探針(Fe3O4-rch 24),并在活體動物模型上開展了磁共振成像(圖12),其研究結果表明Fe3O4-rch 24探針能夠特異性識別皮下移植的結直腸癌腫瘤病灶,產生T2成像對比增強信號.增強信號于注射探針后24 h達到峰值,與注射前相比, T2值下降10%,而對照組(未耦聯抗體的Fe3O4納米顆粒)則沒有顯示明顯的信號下降.

2009年,Liu等39通過對Fe3O4納米晶體表面修飾結構的優化,得到具有更長血液循環時間的生物相容性Fe3O4納米顆粒,以胃癌荷瘤裸鼠為動物模型,以胃癌單克隆抗體3H11為腫瘤靶向分子構建了MR分子影像探針.該探針在靜脈注射24 h后使得腫瘤部位的T2值下降高達30%(圖13),經換算得到的ΔR2接近43%,36是目前文獻報導的最高值.值得一提的是,上述結果是在醫用3 T磁共振儀上采用小動物線圈測得的,因此上述探針更為接近臨床應用.與Cheon等報導的基于磁性氧化鐵納米顆粒的腫瘤MR分子影像探針相比,上述探針由于具有更長的血液循環時間,從而有更多的機會與腫瘤細胞表面抗原相結合,因此表現出更為優異的腫瘤造影增強效果,而采用后者對活體腫瘤進行MRI監控的時間一般小于10 h.32125I示蹤抗體對體內腫瘤的識別動力學結果表明,抗體如3H11在靜脈注射24 h后在腫瘤區域的富集程度達到峰值.39由此可見,有效提高磁性納米顆粒的血液循環時間,使其更好地與腫瘤靶向分子對靶點識別的動力學相匹配是設計納米探針需要考慮的重點問題之一.

單克隆抗體作為靶向分子的優點在于其良好的特異性及靶向性,然而,由于抗體尺寸較大,以其構建得到的探針尺寸更大,增加了被RES系統被動攝取的幾率.因此,一些科學家們也嘗試了采用分子量較小的單鏈抗體、蛋白及多肽等生物分子或腫瘤特異性的小分子如葉酸來構建腫瘤MR分子影像探針.

與單克隆抗體相比,單鏈抗體具有分子量小、通透性強、免疫原性低及不易與具有Fc受體的非靶細胞結合等優點.Yang等借鑒這些優點,在2009年報導了相關研究結果.他們采用表皮生長因子受體(EGFR)相關單鏈抗體ScFvEGFR(single-chain fragment of variable,ScFv)作為靶向性分子,以磁性Fe3O4納米顆粒為載體構建了MR分子影像探針ScFvEGFR-IO(iron oxide,IO),并證明該探針可增強體內原位移植胰腺癌模型腫瘤的磁共振成像.59除單鏈抗體外,一些小分子量的靶向性融合蛋白也被用于構建腫瘤磁共振分子探針,例如,陸菁菁等則采用表面為PEG修飾的Fe3O4納米顆粒與重組人促性腺激素釋放激素融合蛋白——綠膿桿菌外毒素40 (recombinant human gonadotrop in releasing hormonepseudo-monas exotoxin 40,GnRH-PE40)耦聯,構建了腫瘤靶向性分子探針,荷瘤鼠體內進行成像結果表明,該靶向探針可以使腫瘤部位T2信號顯著下降(P＜0.05).60

與單克隆抗體及小分子蛋白相比,多肽及靶向性小分子因具有更小的分子量而備受青睞,例如,蝎氯毒素(chlorotoxin,CTX)是一種由36個氨基酸組成的多肽,CTX可以特異性識別膠質瘤細胞中高表達的MMP-2,因而可以特異性地對膠質瘤進行成像,同時CTX還可發揮腫瘤治療作用.61再如以整合素αvβ3作為靶點的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸RGD多肽(arginine-glycine-aspartic acid,RGD)也被用于與磁性氧化鐵納米顆粒耦聯來構建腫瘤的活體分子影像探針,由于αvβ3在多種腫瘤細胞表面及新生血管中高表達,因此以RGD構建的分子影像探針可被用于多種腫瘤模型,如乳腺癌、惡性黑色素瘤及鱗狀上皮細胞癌等的體內診斷.38,62,63具有腫瘤特異性識別功能的小分子可以更好地利用納米顆粒表面多結合位點的優勢,通過同時耦聯多個腫瘤靶向小分子,利用對腫瘤細胞的多價結合,進而提高探針對腫瘤病灶的有效結合能力.61

圖12 以Fe3O4-rch 24耦聯物為探針檢測活體腫瘤的磁共振結果10Fig.12 In vivo MR detection of tumors by using Fe3O4-rch 24 as molecular probe10(a)T2(upper row)and T2*(lower row)-weighted MR images acquired before and after intravenous injection of Fe3O4-rch 24 mAb conjugates; b)T2*-weighted MR images of two tumors acquired before and at different times after intravenous injections of Fe3O4-rch 24 mAb conjugates(upper row)and Fe3O4@PEG-COOH nanocrystals(lower row),respectively.10

除此之外,由于多種腫瘤細胞表面葉酸(folic acid,FA)受體表達上調,小分子葉酸也常常作為腫瘤靶向分子用于腫瘤磁共振分子影像探針的構建.例如,Zhang團隊58采用Fe3O4-FA耦聯物進行的體外細胞實驗表明Fe3O4-FA耦聯物可以特異性地與腫瘤細胞結合;Shi等65報導的采用樹枝狀分子修飾的磁性氧化鐵與葉酸耦聯形成的腫瘤分子探針,被證明在活體層面上可以實現對表皮癌的磁共振增強.

6.3 基于新型磁性氧化鐵納米顆粒的多模態腫瘤分子影像

圖13 以Fe3O4-3H11-125I為雙模態探針活體檢測腫瘤的磁共振(a)和γ-成像結果(c)及其相關定量分析數據(b,d)39Fig.13 In vivo MR images(a)and γ-images(c)of tumor xenografts together with the corresponding quantification data(b,d)obtained by using Fe3O4-3H11-125I as dual-modal probe(a)T2-weighted MR images of tumor-bearing nude mice acquired before and at different time points after intravenous injections of Fe3O4-3H11-125I and Fe3O4-mIgG-125I,respectively;(b)Variations of T2 values of tumors after the injections of Fe3O4-3H11-125I(solid line)and Fe3O4-mIgG-125I (dotted line),respectively;(c)γ-Images of tumor-bearing nude mice captured at different times postinjection;(d)The normalized γ-counts extracted after injection of Fe3O4-3H11-125I from the whole body(dotted line),the tumor at upper flank region(solid line),and the tumor at proximal thigh region(dashed line)of the mouse at the left-hand side in each image.39

近年來,隨著分子影像的發展,尤其是分子影像探針制備方面的技術突破,腫瘤的分子影像研究已經不僅僅局限于單一模態成像.眾所周知,不同的成像模式各有其優缺點.例如,MRI具有安全、無創、高空間分辨率、多方位及多參數成像等優點,同時所獲得的解剖信息不受組織深度影響;核醫學成像技術以其靈敏度高的優點被廣泛應用于活體成像、體內分子示蹤及藥物體內分布的定性與定量化分析,但是其成像過程受噪聲、散射、衰減和探測器響應的影響,導致圖像質量較差,成像分辨率低,給病灶的空間定位帶來了一定困難;光學分子影像,尤其是基于熒光及生物發光的光學分子影像方法同樣具有高靈敏度、高時空分辨率、安全無創等優點,既適用于獲得豐富的生物學信息,又可用于反映體內分子生物學事件的細節過程.光學分子影像學方法目前存在的主要缺點是成像空間分辨率低以及測量范圍和探測深度有限(1-2 cm)等.3,66同時,激發光造成的背景噪聲及探針非特異性識別產生的背景噪聲,組織對光學信號的散射、折射和吸收等因素使光學分子影像學在臨床應用方面仍面臨一定的困難.

由此可見,單一模態成像方法仍面臨一定的局限性,因此,整合各種成像技術的優勢,發展多模態分子影像手段,彌補單模態成像的缺陷,實現分子影像學在腫瘤早期診斷及在體定量分析方面的應用已經成為分子影像學進一步發展的重要方向.2,65多模態分子影像不僅可以彌補單一模態成像的不足和缺陷,更為準確地反映微小腫瘤形態與定位,同時還有助于獲得精確的探針藥代動力學信息,驗證腫瘤靶向診斷的有效性.腫瘤多模態分子影像在國際上剛剛起步,目前已有核素/光學成像、67-69核素/MRI、39,70光學/MRI71等雙模腫瘤分子探針方面的研究報導.

6.3.1 核素/MRI雙模態分子影像探針及其成像應用

從截止目前的研究報導看,核素/MRI雙模態探針的構建基本采用如下兩種策略:(1)直接將放射性核素加載于磁性納米顆粒,獲得同時可被MRI和核醫學成像技術探測到的雙功能探針;(2)利用放射性核素標記某種蛋白分子,如腫瘤相關抗體,再將核素標記的蛋白分子與磁性納米顆粒進行耦聯,獲得雙模態分子影像探針.

2008年,Cheon團隊72報導了采用磁性MnFe2O4(MnMEIO)納米晶體和124I標記的血清白蛋白(serum albumin,SA)構建的PET/MRI雙模態成像探針124ISA-MnMEIO,并將該探針用于鼠的活體前哨淋巴結成像.由于腋下淋巴結組織深度較深,因此不能夠在MRI圖像中明顯辨別,而PET成像很好地彌補了這一缺陷;同時,MRI則為臂淋巴結提供了良好的解剖學信息.該探針對前哨淋巴結的診斷對于腫瘤的早期轉移診斷具有潛在的應用價值.

2010年,Glaus等73報導了采用反相微乳液法制備的單分散性Fe3O4納米顆粒,然后采用1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino (polyethylene glycol)2000](DSPE-PEG2000-amine)及DSPE-mPEG5000,通過相轉移法實現了納米顆粒表面的PEG修飾;再利用顆粒其表面的氨基與DOTA-NHS(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid mono(N-hydroxysuccinimide ester))進行反應,將DOTA耦聯到納米顆粒表面;最后利用DOTA對銅離子的螯合作用,得到了標記有64Cu的PET/MRI納米顆粒探針.對該探針的體內分布研究表明其血液半衰期為143 min,然而該探針并無腫瘤靶向性.

2009年,Liu等39報導了以生物相容性磁性氧化鐵納米晶體為核心構建的MRI/SPECT雙模態腫瘤分子影像探針,及其在荷瘤鼠腫瘤診斷方面的研究結果.他們通過共價耦聯PEG修飾的生物相容性磁性Fe3O4納米顆粒、125I與人源化抗胃癌單克隆抗體3H11,構建了針對胃癌的MRI/SPECT雙模態分子影像探針(Fe3O4-3H11-125I).荷瘤鼠動物模型實驗結果表明,該探針能有效識別活體腫瘤病灶,進而實現小尺寸腫瘤(200-250 mm3)在MRI和SPECT兩種成像模態下的靶向成像(圖13).進一步的量化結果表明該探針使腫瘤病灶區域的T2值下降達30%,遠高于對照組的非相關抗體耦聯物(Fe3O4-IgG-125I)在相同時間窗口內導致的T2下降值(～10%).相關研究結果還表明,基于125I的核素成像不僅可以用于驗證磁共振的實驗結果,還可以用于揭示磁性氧化鐵納米顆粒的代謝及體內分布情況.更重要的是,構建該雙模態探針的技術路線還可以拓展到碘的其它放射性同位素,進而獲得MRI/PET雙模態或集成像與治療一體的多功能探針.39

6.3.2 磁共振/光學雙模態探針及其成像應用

目前,活體熒光成像研究已經成為分子影像領域最活躍的研究方向之一.一方面,用于標記基因、多肽、抗體等生物分子的熒光標記技術日臻成熟,實驗操作簡單;另一方面,相關熒光成像技術成熟且檢測靈敏度高,且結合不同種類的熒光染料可對目標分子進行多重熒光標記.74,75在活體應用方面,與核醫學成像相比,活體熒光成像技術的優勢體現在實驗成本低,實驗簡便,操作安全,測量快速,可方便實現對實驗動物的長期跟蹤測量并獲得相似的體內信息.盡管熒光檢測具有非常高的靈敏度,其缺點在于活體成像的分辨率較低(2-3 mm),成像結果容易受到實驗樣本的背景熒光(如小動物皮毛和血液的背景熒光)和激發光的干擾.動物組織對可見光信號吸收和散射也在很大程度上限制了活體熒光成像對深部病變的成像能力、空間定位能力以及定量分析能力,因此活體光學成像需要其它成像模態來提供深部病變的空間定位信息.目前,商品化的小動物熒光成像系統,多與CT聯用實現對待測部位的空間定位.然而,利用納米材料特殊的體內分布行為及其在腫瘤部位特殊的滯留效應,以磁性納米顆粒作為光學探針載體構建納米探針,可充分利用高成像分辨率的MRI為光學成像提供空間定位信息,這無疑是一個理想的選擇.

目前,MRI/光學分子影像探針的構建方式包括熒光染料與磁性納米顆粒的直接耦聯和間接耦聯兩種.在光學探針分子的選擇方面多傾向于采用小分子染料,尤其是可進行體內光學成像的近紅外熒光染料如Cy5.5、76,77IRDye80078等.

2009年,Zhang團隊76報導了MRI/光學雙模態分子靶向探針及相關活體腫瘤成像結果.他們首先采用共沉淀法制備了殼聚糖修飾的Fe3O4納米顆粒,再通過對該顆粒表面進行PEG、Cy5.5及氯毒素共修飾,構建了對腦部髓母細胞瘤進行雙模態成像的腫瘤分子影像探針.活體實驗結果表明,該熒光探針可以用于裸鼠腦部腫瘤的高靈敏度成像,而磁共振成像則為腫瘤的空間定位提供了有效的幫助.另外,他們還發現上述探針可以穿越血腦屏障,這一結果有可能為腦部腫瘤成像探針的構建提供一種新的策略.

2009年,Nie團隊77報導了一種對胰腺癌腫瘤具有選擇性識別特性的靶向型MRI/光學雙模態分子探針.他們以尿激酶型纖溶酶原激活物受體(urokinase plasminogen activator receptor,uPAR)為靶標,采用高溫熱分解方法制備了油溶性Fe3O4納米晶體,再通過相轉移法獲得了水溶性Fe3O4納米顆粒,采用Cy5.5標記的uPA氨基端片段(aminoterminal fragment,ATF,氨基端第1-135氨基酸殘基)在上述水溶性納米顆粒表面的共價耦聯構建了一種MRI/光學雙模態成像探針.該探針中的ATF多肽可與uPAR內源性配體uPA競爭結合于高表達uPAR的胰腺癌細胞表面,由于uPAR僅高表達于胰腺癌細胞表面,所以該探針對慢性胰腺炎等臨床上易與胰腺癌混淆的疾病并無特異性識別,因此為胰腺癌的早期鑒別診斷用分子影像探針的構建提供了新思路.

6.3.3 MRI/核素/光學多模態成像探針及相關成像研究

除雙模態成像探針外,納米顆粒表面多結合位點的特點使得以納米材料為核心構建多模態成像探針成為可能.最近,Chen團隊79以新型氧化鐵納米顆粒為核心構建了MRI/核素/光學多模態探針,他們采用多巴胺通過配體交換法置換油溶性的Fe3O4納米顆粒表面修飾的油酸使納米顆粒具有水溶性,然后通過靜電相互作用將人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)吸附到納米顆粒表面,接著對納米顆粒表面的HSA進行Cy5.5及DOTA標記,最后將64Cu加入體系中與DOTA反應完成核素標記,得到MRI/核素/光學三模態探針.以荷瘤裸鼠為動物模型的體內腫瘤成像研究表明,該探針通過EPR (enhanced permeability and retention)效應可實現對腫瘤的MRI、PET及NIRF(near-infrared fluorescence)成像.此外,體內分布實驗結果表明,該探針具有相對較長的血液循環時間,這也是其能夠通過EPR效應實現腫瘤成像的主要原因之一.

由此可見,以磁性納米顆粒作為磁共振造影劑,同時作為多模態分子影像探針的載體,實現腫瘤多模態分子影像探針的構筑目前已經成為一個重要的發展趨勢.這是因為以磁性納米顆粒為核心的腫瘤多模態分子影像探針在腫瘤研究中體現出小分子探針所不具備的獨特優勢:(1)磁性氧化鐵納米顆粒以更大的尺寸,在經適當表面修飾后可獲得比小分子探針更長的血液循環時間,因此有更多的機會通過血液循環到達病灶部位,實現有效富集; (2)納米材料由于表面具有更多的結合位點,因此是構建多模態分子影像探針的理想平臺.與小分子探針不同的是,納米顆粒探針一方面可以利用EPR效應來實現腫瘤診斷;另一方面可通過表面加載的對腫瘤相關靶點具有特異性識別功能的腫瘤靶向分子實現對微小腫瘤的早期診斷及鑒別診斷.而在此基礎之上,采用先進的納米技術及生物技術構建對腫瘤具有智能響應特性的先進功能探針,有望在實現腫瘤早期診斷和鑒別診斷的同時,為與腫瘤發生發展過程密切相關的惡性生物學事件提供原位實時的分子信息,因此必將成為下一代腫瘤分子影像探針研究的核心內容.

腫瘤多模態探針的構建及其在體動態可視化研究具有深遠的臨床意義,相關研究一方面有望產生具有臨床應用價值的新技術和新產品,另一方面為腫瘤的發生、發展、凋亡、轉移與預后提供必要的相關知識與信息.毫無疑問,腫瘤分子影像學的發展不僅取決于相關成像技術與設備的發展,同時還強烈地依賴于先進的多模態分子影像探針的發展.磁性氧化鐵納米顆粒以其優異的體內安全性、更高的磁敏感性、表面多結合位點及依賴于納米顆粒尺寸的特殊體內行為,被認為是構建多模態腫瘤分子影像探針的首選材料.隨著新型磁性氧化鐵納米顆粒制備技術及表面修飾技術的逐漸發展,磁性氧化鐵納米顆粒勢必成為構建下一代具有臨床應用價值的腫瘤分子影像探針的首選材料.

7 展望

得益于最近10年新型磁性氧化鐵納米顆粒的制備及表面修飾技術的高速發展,納米顆粒在腫瘤分子影像領域的應用取得了快速的進步,以新型氧化鐵納米顆粒為核心構建的腫瘤單模態、多模態分子影像探針層出不窮.然而,實現磁性氧化鐵納米顆粒在腫瘤磁共振分子影像中的應用仍然面臨以下幾個重要問題:(1)窄粒度分布的生物相容性磁性納米顆粒的連續可控制備;(2)磁性納米顆粒的體內免疫逃逸控制;(3)納米探針的體內分布與探針尺寸的相關性;(4)多模態分子影像探針的構建策略;(5)針對腫瘤診斷的生物靶點分子的篩選等.

隨著腫瘤診斷研究的逐漸深入,腫瘤臨床診斷正逐漸向分子層面擴展,這勢必促使醫學影像學從簡單地提供腫瘤形態信息向同時提供形態與分子信息的方向發展,在準確反映微小腫瘤空間定位信息的同時,最終以安全無創的方式提供微小腫瘤的發生發展及侵襲轉移過程中的重要相關分子信息,從而為腫瘤的早期診斷及個體化診療提供臨床解決方案.由此可見,腫瘤分子影像無疑將成為納米醫學未來發展的一個重要方向.

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Magnetic Iron Oxide Nanoparticle——an Important Cornerstone of MR Molecular Imaging of Tumors

QIAO Rui-Rui1ZENG Jian-Feng1JIAQiao-Juan1DU Jun2SHEN Lin3GAO Ming-Yuan1,*
(1Institute of Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,P.R.China;2Laboratory of Microbial and Biochemical Pharmacy,School of Pharmaceutical Sciences,Sun Yat-Sen University,Guangzhou 510006,P.R.China;3Beijing Institute for Cancer Research,Peking University School of Oncology,Beijing 100036,P.R.China)

This review summaries the syntheses and applications of magnetic iron oxide nanocrystals that have been published worldwide.In particular,it discusses the future applications of magnetic iron oxide nanoparticles in molecular imaging of tumors.

Magnetic nanoparticle;Tumor;Magnetic resonance;Molecular imaging; Multi-modality

10.3866/PKU.WHXB201203023

?Corresponding author.Email:gaomy@iccas.ac.cn;Tel:+86-10-82613214.

The project was supported by the National Key Basic Research Program of China(973)(2011CB935800)and National Natural Science Foundation of China(81090271,21003135,20820102035).

國家重點基礎研究發展計劃(973)(2011CB935800)和國家自然科學基金(81090271,21003135,20820102035)資助項目

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