鏈霉菌TD－1菌株抑菌活性物質(zhì)發(fā)酵條件的優(yōu)化

楊曉靜， 王昌祿， 王志芳， 李風(fēng)娟， 陳勉華， 王玉榮

(天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室/食品科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

鏈霉菌TD－1菌株抑菌活性物質(zhì)發(fā)酵條件的優(yōu)化

楊曉靜， 王昌祿， 王志芳， 李風(fēng)娟， 陳勉華， 王玉榮

(天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室/食品科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

利用正交設(shè)計法及均勻設(shè)計法對鏈霉菌TD－1菌株發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，研究不同發(fā)酵因子對鏈霉菌TD－1產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響．結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基中影響抑菌活性大小的主要因素為葡萄糖、黃豆粉、硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀及硝酸鉀;抑菌活性物質(zhì)較佳發(fā)酵條件為90 mL/250 mL三角瓶，接種量的體積分?jǐn)?shù)為0.06，發(fā)酵周期8 d，初始pH值為7.15．在此條件下，最終抑菌效率與原發(fā)酵液相比發(fā)酵液對串珠鐮刀菌抑菌活性提高了53.38%．

王昌祿，男，教授，主要從事食品生物技術(shù)方面的研究．通訊作者．

鏈霉菌TD－1;抑菌活性物質(zhì);發(fā)酵條件

真菌及其毒素能通過糧食、飼料和畜產(chǎn)品等途徑危害人類及動物健康，其中鐮孢菌屬(Fusarium)中的串珠鐮刀菌是糧食及飼料中的常見霉菌，其嚴(yán)重性已經(jīng)被人們所公認(rèn)．如何抑制糧食、飼料中霉菌及其毒素，減輕其危害，已成為眾多學(xué)者研究的熱點［1－2］．在對真菌及其毒素的防治中，化學(xué)防霉防腐劑發(fā)揮著舉足輕重的作用．但由于過量使用化學(xué)防霉防腐劑引起的一系列環(huán)境及社會問題越來越引起人們的重視，我國政府將重點致力于生物殺蟲劑、殺菌劑的研究與產(chǎn)業(yè)化［3］．

據(jù)統(tǒng)計，目前已獲得的天然產(chǎn)物化合物總量已超過100萬種，其中微生物代謝產(chǎn)物約為2萬多種［4］，而從微生物代謝產(chǎn)物中分離得到的活性化合物直接使用的有150～160個［5－6］．放線菌是重要的微生物資源，其產(chǎn)生的活性成分具有周期短、易于研究、無毒無害等優(yōu)點，一直是研究者關(guān)注的焦點［7－10］．特別是鏈霉菌能產(chǎn)生多種防霉防腐的活性物質(zhì)［11－12］．本研究在前期研究［13－14］的基礎(chǔ)上，對能夠抑制多種產(chǎn)毒素霉菌的鏈霉菌TD－1菌株產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的發(fā)酵條件及最佳培養(yǎng)基配方進行了優(yōu)化．

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 菌株

實驗菌株:鏈霉菌TD－1，從天津市寶坻區(qū)某飼料廠儲糧倉庫周圍土壤中篩選獲得．

指示菌株:串珠鐮刀菌(Fusarium moniliforme)，由天津市畜牧獸醫(yī)研究所提供．

1.1.2 培養(yǎng)基

液體發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉20.0 g，黃豆粉10.0 g，KNO31.0 g，K2HPO40.5 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g ，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，自來水1 000.0 mL，pH 值為7.2～7.4;121℃，滅菌20 min．

1.1.3 試劑

碳源為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、檸檬酸三鈉、乙酸鈉、可溶性淀粉;氮源為蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、黃豆粉、尿素、硫酸銨、硝酸銨;無機鹽為氯化鈣、硫酸亞鐵、硝酸鉀、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氯化鈉、氯化鉀．

1.1.4 儀器

1類B型超凈工作臺，上海博訊事業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;LS－B50L型立式壓力蒸汽滅菌器，上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司;HYG－III型回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜，上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司;牛津杯，外徑8 mm，上海黃海藥檢儀器銷售有限公司．

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液的制備

28℃培養(yǎng)3～4 d活化TD－1菌株，刮取孢子制成菌懸液，接種于裝有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28～30℃，180 r/min搖床中培養(yǎng)5～6 d．

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化

1.2.2.1 無機鹽正交試驗

以串珠鐮刀菌為指示菌，以氯化鈣、硫酸亞鐵、硝酸鉀、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氯化鈉、氯化鉀7種無機鹽作為實驗因素，選用正交設(shè)計表L18(37)，各因素設(shè)定3個水平(如表1)，牛津杯法［15－16］測定不同濃度無機鹽對TD－1菌株產(chǎn)抑菌活性的影響．

表1 各因素試驗水平Tab．1 Level of each factor g·(100 mL_－1)

1.2.2.2 培養(yǎng)基成分正交試驗

選用正交設(shè)計表中L9(34)，以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、檸檬酸三鈉、乙酸鈉作為碳源因素，以蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、黃豆粉、尿素、硫酸銨、硝酸銨作為氮源因素，經(jīng)單因素試驗選用較優(yōu)碳、氮源作為培養(yǎng)基成分正交試驗因素;在無機鹽正交實驗的基礎(chǔ)上，選用較優(yōu)無機鹽作為培養(yǎng)基成分正交因素，每個因素分別設(shè)置3個濃度水平，確定優(yōu)化后的鏈霉菌菌株TD－1發(fā)酵培養(yǎng)基成分．

1.2.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化

選取對菌株TD－1產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)影響較大的4個發(fā)酵條件進行優(yōu)化，4個主要條件為:裝液量、接種量、發(fā)酵時間、pH值．從均勻設(shè)計表中選用表，每個因素水平設(shè)為10．

1.2.4 優(yōu)化效果對比試驗

根據(jù)上述實驗結(jié)果，菌株TD－1分別在優(yōu)化發(fā)酵條件、最優(yōu)培養(yǎng)基條件下和原始發(fā)酵條件、原始培養(yǎng)基條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)，以串珠鐮刀菌為指示菌，牛津杯法測定2種發(fā)酵條件對菌株TD－1產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響，實驗重復(fù)進行3次，取平均值作為最終結(jié)果，比較優(yōu)化后抑菌效果提高率．

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基配方的優(yōu)化

2.1.1 無機鹽對菌株TD－1發(fā)酵液活性的影響

選用不同的無機鹽進行正交試驗，結(jié)果如表2，比較各因素的極差R可知，硝酸鉀(R，1.57)、水合硫酸亞鐵(R，1.28)及磷酸氫二鉀(R，1.23)為影響發(fā)酵液抑菌活性的主要因素;試驗各因素水平的平均數(shù)表明對菌株TD－1發(fā)酵液抑菌物質(zhì)影響較大的是硝酸鉀、水合硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀．

表2 無機鹽正交試驗結(jié)果Tab．2 Data of orthogonal test of inorganic salts mm

2.1.2 碳源對菌株TD－1產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響

選取葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、檸檬酸鈉、乙酸鈉為碳源，測定其對抑菌活性的影響.結(jié)果表明，等量替換原始發(fā)酵培養(yǎng)基中的可溶性淀粉時，其抑菌效果由大到小依次為葡萄糖＞檸檬酸鈉＞甘油＞蔗糖＞麥芽糖＞乙酸鈉(如圖1)．所選碳源均能使菌株TD－1發(fā)酵液產(chǎn)生抑菌活性，其中葡萄糖為碳源時，產(chǎn)生的抑菌活性最大，抑菌圈直徑達19.8 mm，故選葡萄糖代替淀粉作為碳源進行發(fā)酵培養(yǎng)基配方的進一步優(yōu)化．

圖1 碳源對抑菌活性物質(zhì)活性的影響Fig．1 Influence of different carbon sources on antifungal activity

在測定不同碳源對菌株TD－1抑菌活性影響的基礎(chǔ)上，將抑菌活性較高的葡萄糖、甘油、檸檬酸三鈉3種碳源分別按質(zhì)量濃度為0.02，0.05，0.08 g/mL加入到培養(yǎng)基中作為碳源，進行單因素濃度對抑菌活性的測定，結(jié)果如圖2．隨葡萄糖濃度的增大，抑菌效果先增大后減小，這可能是由于胞外滲透壓過大培養(yǎng)基中碳氮比例失衡引起的;而甘油和檸檬酸三鈉質(zhì)量濃度為0.02 g/mL時，抑菌效果最好．甘油隨質(zhì)量濃度的增大，抑菌物質(zhì)活性有所下降，這可能與發(fā)酵液粘度過大不利于發(fā)酵造成的，檸檬酸三鈉質(zhì)量濃度為0.08 g/mL時抑菌物質(zhì)活性有所回升，但用量過大不利于發(fā)酵．從經(jīng)濟性考慮，選用葡萄糖質(zhì)量濃度為0.05 g/mL時為最宜．

2.1.3 氮源對菌株TD－1產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響

選用蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、尿素、硫酸銨、硝酸銨為氮源，以黃豆粉作為對照，測定其對抑菌活性的影響．結(jié)果表明，在以酵母浸粉、硫酸銨作為氮源時，菌株TD－1發(fā)酵培養(yǎng)時不能合成抑菌活性物質(zhì)，發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化時不再考慮此2種氮源．其他氮源對抑菌活性的測定，結(jié)果如圖3，其中以牛肉膏產(chǎn)生抑菌物質(zhì)活性最大，抑菌圈直徑達18.0 mm．各不同氮源抑菌效果由大到小依次為黃豆粉＞蛋白胨＞硝酸銨＞尿素(如圖3)．

圖2 不同質(zhì)量濃度碳源對抑菌物質(zhì)活性的影響Fig．2 Influence on active substance production of different concentration carbon

圖3 氮源對抑菌物質(zhì)活性的影響Fig．3 Influence of different nitrogen sources on antifungal activity

在測定不同氮源對菌株TD－1抑菌活性影響的基礎(chǔ)上，將抑菌活性較好的蛋白胨、牛肉膏、黃豆粉，分別按質(zhì)量濃度為0.01，0.025，0.04 g/mL加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，檢測結(jié)果如圖4．黃豆粉作為氮源時，隨用量增大抑菌效果先增大后減小，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.01 g/mL時，抑菌圈最大;質(zhì)量濃度為0.04 g/mL時，抑菌活性下降．蛋白胨隨質(zhì)量濃度的增大抑菌活性反而降低．牛肉膏在質(zhì)量濃度增大時，抑菌物質(zhì)活性隨之增大，但成本過高，故選黃豆粉質(zhì)量濃度為0.01 g/mL時為較佳條件．

圖4 不同質(zhì)量濃度氮源對抑菌物質(zhì)活性的影響Fig．4 Influence on active substance production of different concentration nitrogen

2.1.4 培養(yǎng)基成分正交試驗

在碳氮源單因素及無機鹽正交試驗基礎(chǔ)上，分別選用對抑菌活性物質(zhì)影響較大的碳源(葡萄糖)、氮源(黃豆粉)及無機鹽(水合硫酸亞鐵與磷酸氫二鉀)進行正交試驗，通過正交L9(34)設(shè)計，得出結(jié)果如表3，從各因素的R值看出，培養(yǎng)基成分影響抑菌活性產(chǎn)生的主次順序為:水合硫酸亞鐵與磷酸氫二鉀組合(R，3.6)＞ 葡萄糖(R，3.3)＞硝酸鉀(R，2.5)＞黃豆粉(R，1.1)，分析k值可知4種因素的最優(yōu)配比水平為:葡萄糖65 g/L，硝酸鉀0.5 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，水合硫酸亞鐵0.01 g/L．

表3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化最終正交試驗結(jié)果Tab．3 Data of final fermentation optimization g·(100 mL －1)__

對以上結(jié)果進行F值顯著性檢驗，結(jié)果如表4，分析可知水合硫酸亞鐵與磷酸氫二鉀組合、葡萄糖對菌株TD－1發(fā)酵液產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)影響較大，即2種因素對實驗結(jié)果有顯著差異性，其中水合硫酸亞鐵與磷酸氫二鉀組合與葡萄糖相比，對菌株TD－1發(fā)酵液產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響較大．根據(jù)前期實驗室對菌株TD－1的研究，此結(jié)果可能與TD－1菌株本身的生物學(xué)特性有關(guān)［13］．

綜上所述，優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為葡萄糖65 g/L、黃豆粉10 g/L、硝酸鉀0.5 g/L、水合硫酸鎂1 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L、氯化鈉0.5 g/L、氯化鉀0.2 g/L、水合硫酸亞鐵0.01 g/L．

表4 發(fā)酵培養(yǎng)基配方F檢驗Tab．4 F-test of composition of fermentation medium

2.2 培養(yǎng)條件對菌株TD－1產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響

在培養(yǎng)基成分優(yōu)化的基礎(chǔ)上進行均勻試驗設(shè)計，選取對菌株TD－1發(fā)酵影響較大的4組培養(yǎng)條件:裝液量、接種量、培養(yǎng)時間及pH，測定各培養(yǎng)條件不同水平下對抑菌活性大小的影響，結(jié)果如表5，通過DPS軟件對試驗結(jié)果進行偏最小二乘回歸建模分析，最終得到菌株TD－1較優(yōu)培養(yǎng)條件為:搖瓶裝液量90 mL/250 mL三角瓶、接種量的體積分?jǐn)?shù)為0.06、發(fā)酵周期8 d、初始pH值7.15，其他培養(yǎng)條件不變．從偏最小二乘回歸方程

得菌株TD－1理論上的抑菌值為30.36 mm．

表5 均勻設(shè)計試驗結(jié)果Tab．5 Data of uniform test

表6 優(yōu)化發(fā)酵結(jié)果與原始發(fā)酵結(jié)果抑菌效果對比Tab．6 Comparison between optimizated results and original fermentation

2.3 優(yōu)化發(fā)酵結(jié)果與原始發(fā)酵結(jié)果抑菌效果判斷

分別測定菌株TD－1在優(yōu)化前后的發(fā)酵條件產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的大小，結(jié)果如表6．由表6可知，優(yōu)化后TD－1抑菌效果由原來的17.3 mm增大到優(yōu)化后的26.6 mm，抑菌率提高了53.3%．優(yōu)化后實驗結(jié)果為26.6 mm，與偏最小二乘回歸方程得到的理論值30.3 mm之間的相對偏差為5.8%，小于10%，說明均勻試驗得到的回歸方程較好的反映了實際情況，對實際生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義．

3 討論

通過實驗，確定了培養(yǎng)基中不同成分對鏈霉菌菌株TD－1產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響，通過極差R判斷，影響因素主次排列順序為:水合硫酸亞鐵與磷酸氫二鉀組合(R，3.6)＞葡萄糖(R，3.3)＞硝酸鉀(R，2.5)＞黃豆粉(R，1.1)，并得出較佳培養(yǎng)條件為搖瓶裝液量90 mL/250 mL三角瓶，接種量的體積分?jǐn)?shù)為0.06，發(fā)酵周期 8 d，初始 pH值7.15，抑菌物質(zhì)的活性較優(yōu)化前提高了53.38%．以上結(jié)果為TD－1菌株進行發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)提供了依據(jù)．

菌株TD－1所產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)對飼料、糧食中霉菌有較強的抑制作用，在目前文獻資料的報道中較為少見，該抑菌活性物質(zhì)有望成為新型的微生物源農(nóng)藥，用于儲糧及飼料儲藏中霉菌防治必將有廣闊的發(fā)展前景．后續(xù)工作中需繼續(xù)根據(jù)菌株TD－1生長及產(chǎn)素的營養(yǎng)要求特點，在生物調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)上，進行高密度大規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng)，提高活性物質(zhì)產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本．

［1］Hussein H S，Brasel J M．Toxicity，metabolism and impact of mycotoxins on humans and animals［J］．Toxicol，2001，167(2):101-134．

［2］蘇永騰，劉強．谷物霉菌毒素的危害及其控制措施的研究［J］．中國食物與營養(yǎng)，2010，34(4):9-12．

［3］沈寅初，張一賓．生物農(nóng)藥［M］．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2000．

［4］Knight V，Sanglier J J，DiTullio D，et al．Diversifying microbial natural products for drug Discovery［J］．Appl Microbiol Biotechnol，2003，61(2):446-458．

［5］Fehér M，Schmidt J M．Property．Distributions:Differences between drugs，natural products，and molecules from combinatorial chemistry［J］．J Chem Inf Comput Sci，2003(43):218-227．

［6］Richard H B．Antimicrobials from actinomycetes:back to the future［J］．Microbe，2007，2(3):125-131．

［7］Carl S，Wiesel M．Mycophenolate mufti［MMF］for prevention of kidney transplant rejection．A new immunosuppressive agent，international mycophenolate mofetil study group［J］．Urologe A，2011，37(3):26-28．

［8］Wessjohann L．Epothilones，Promising natural products with taxol-like activity［J］．Angew Chen Int Ed Engl，2007，3(6):715．

［9］Hardt I H，Steinmeta H．New natural epothilones from sporangium cellulosum，strains Soce 90/B2 and Soce 90/DB:isolation，structure，elucidation and SAR studies［J］．J Nat Prod，2001，64(7):847．

［10］姜怡，唐蜀昆，張玉琴，等．放線菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)［J］．微生物學(xué)通報，2007，34(1):188-190．

［11］Kayakir H，Takase S，Shibata T，et al．Structure of Kifunensine，a new immunomodulator isolated from an actinomycete［J］．J Org Chem，1989，5(4):4015-4016．

［12］Ahn C，Stiles M E．Plasmid-associated bacteriocin Production by a strain of Carnobacterium Piscicola from meat［J］．Applied and Environmental Mierobiology，1990，56(8):2503-2510．

［13］劉春靜，王昌祿，陳勉華，等．串珠鐮刀菌拮抗菌的分離篩選及其抑菌作用［J］．糧食與飼料工業(yè)，2011(1):41-43．

［14］王昌祿，鄭傳寶，陳勉華，等．產(chǎn)粉紅色素紅曲霉M4菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］．氨基酸和生物資源，2010，2(32):26-29．

［15］彭小偉，楊麗源，陳有為，等．黃花夾竹桃內(nèi)生真菌抗病原細菌的初步研究［J］．菌物研究，2003，1(1):33-36．

［16］孫力軍，陸兆新．植物內(nèi)生菌抗菌活性物質(zhì)研究進展［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，2(31):51-57．

(責(zé)任編輯:李 寧)

Optimization of Fermentation Conditions for Antibacterial Activity Substance Produced by Streptomyces TD-1

YANG Xiao-jing， WANG Chang-lu， WANG Zhi-fang， LI Feng-juan， CHEN Mian-hua， WANG Yu-rong
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety of Ministry of Education/College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China)

Fermenting conditions for antibacterial activity substance produced by Streptomyces TD-1 was optimized by orthogonal and homogeneous test design method．The effects of different experimental factors on Streptomyces TD-1 producing antibiotic substance were studied．The results showed that the most important factors which influence the antibacterial activity were glucose，soy flour，F(xiàn)eSO4，K2HPO4and KNO3;the optimized cultural conditions were the initial pH 7.15，culture temperature 30℃，6%of inoculum，the amount of shake flask 90 mL/250 mL，shaking speed 180 r/min and fermentation time 8 d．The final results showed that the antifungal activity of the fermentation broth could increase by 53.38%．

Streptomyces TD-1;antibacterial activity substance;fermenting conditions

1671-1513(2012)05-0046-06

2012-01-15

楊曉靜，女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù);

TS205.9

A