纖維素酶提取漳州血柚皮總黃酮的工藝研究

陳文娟， 陳建福

(1．漳州城市職業(yè)學(xué)院生物與環(huán)境工程系，福建漳州 363000;2．漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，福建漳州 363000)

纖維素酶提取漳州血柚皮總黃酮的工藝研究

陳文娟1， 陳建福2

(1．漳州城市職業(yè)學(xué)院生物與環(huán)境工程系，福建漳州 363000;2．漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，福建漳州 363000)

以漳州血柚皮為原料，利用纖維素酶對(duì)血柚皮總黃酮進(jìn)行提取，并以硝酸鋁顯色法測(cè)定總黃酮提取率．分別對(duì)酶用量、pH值、酶解溫度、酶解時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)，并通過(guò)極差、方差分析對(duì)提取過(guò)程顯著影響提取率的因素進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析．結(jié)果表明，纖維素酶提取血柚皮中的總黃酮的優(yōu)選工藝條件為:酶用量5.5%，pH 5.2，酶解溫度52℃，酶解時(shí)間為50 min，該工藝條件下血柚皮總黃酮的提取率可達(dá)1.52%．

血柚皮;總黃酮;纖維素酶

平和紅肉蜜柚是一種由漳州平和傳統(tǒng)的琯溪蜜柚基因芽變而誕生的柚類(lèi)新品種，素有“天然水果罐頭”之稱(chēng)，因其肉色血紅，坊間有人形象地稱(chēng)之為“血柚”，血柚所含的天然色素對(duì)人體具有一定的保健作用［1－3］．血柚皮占整個(gè)血柚果質(zhì)量的40%，血柚皮中還含有經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的黃酮類(lèi)化合物等活性成分，具有多種生物學(xué)活性和藥理作用，可作為消炎、抗病毒、抗過(guò)敏、鎮(zhèn)痛、降低血黏度和活血解痙類(lèi)藥物的主要成分［4－7］．酶法輔助提取是近年來(lái)廣泛應(yīng)用的一種優(yōu)良的提取方法，纖維素酶能催化使植物組織細(xì)胞壁疏松、破裂，提高傳質(zhì)系數(shù)，具有生產(chǎn)能耗低，提取率高，環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，在生物活性物質(zhì)的提取方面越來(lái)越受到廣泛的重視［8－9］．本文采用纖維素酶提取血柚皮中的總黃酮，并對(duì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，為血柚皮的深加工提高副加值提供理論基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;SHZD循環(huán)水式真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;UV－2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠(chǎng);HH－4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司;DHG－9076A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司．

纖維素酶，寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，上海滬宇生物試劑公司;乙醇，分析純，使用時(shí)，配制濃度(體積分?jǐn)?shù)，下同)為70%或80%的乙醇溶液;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純，使用時(shí)，配制成不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液;鹽酸、磷酸鹽根據(jù)所需pH值配制成緩沖溶液;血柚皮，漳州市售血柚．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取105℃下干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用80%的乙醇溶液溶解并定容至100 mL，搖勻得到100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品溶液．分別量取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL 分別置于10 mL的容量瓶中，加0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2溶液，搖勻放置6 min，再加0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al(NO3)3溶液，搖勻，放置6 min，再加4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH溶液，搖勻放置20 min，加80%乙醇至刻度，搖勻，放置30 min，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并繪制總黃酮質(zhì)量濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)．

1.2.2 血柚皮總黃酮的提取

將市場(chǎng)采購(gòu)的血柚剝皮，將血柚皮自然晾干，于50℃干燥箱中干燥至恒重，冷卻，粉碎，過(guò)100目篩備用．準(zhǔn)確稱(chēng)取備用的血柚皮粉末5 g，置于250 mL的燒瓶中，加入適量的酶(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以血柚皮粉末量為基準(zhǔn)，下同)，以緩沖溶液調(diào)節(jié)pH值，在設(shè)置的條件下酶解，酶解結(jié)束后于95℃水浴5 min滅酶，抽濾，收集濾渣和濾液，備用．將酶解后的濾渣加入70%乙醇，在料液比1∶30，提取溫度60℃提取1 h，抽濾，濾液與酶解后得到的濾液合并置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，定容，按照1.2.1的方法，在510 nm下測(cè)定樣品液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程，計(jì)算血柚皮中總黃酮的提取率，見(jiàn)公式(1)．

式(1)中:C為按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出的總黃酮質(zhì)量濃度，mg/L;V為提取液體積，L;m為提取血柚皮的質(zhì)量，g．

2 結(jié)果與討論

2.1 總黃酮提取率的影響因素

2.1.1 酶用量對(duì)血柚皮總黃酮提取率的影響

纖維素等多糖類(lèi)物質(zhì)被纖維素酶水解后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁的部分破損、使得細(xì)胞膜變得疏松，增加了向主體溶劑擴(kuò)散的擴(kuò)散系數(shù)，有利于細(xì)胞內(nèi)的總黃酮類(lèi)物質(zhì)的浸提．在pH 5.5，酶解溫度55℃，酶解時(shí)間60 min的條件下，考察酶用量對(duì)血柚皮中總黃酮提取率的影響，其結(jié)果見(jiàn)圖1．

圖1 酶用量對(duì)總黃酮提取率的影響Fig．1 Effect of enzyme concentration on extraction efficiency of total flavonoids

從圖1中可以看出，隨著纖維素酶用量的增加，總黃酮提取率增大，當(dāng)酶用量達(dá)到0.6%時(shí)，提取率達(dá)到最大值，繼續(xù)增加酶的用量，提取率反而下降．這是因?yàn)殡S著酶用量的增加，酶濃度增大，提高了酶促進(jìn)反應(yīng)速率，增大了酶對(duì)細(xì)胞壁的破壞能力，使得黃酮類(lèi)物質(zhì)提取率增加;但當(dāng)酶用量達(dá)到0.6%時(shí)，溶液中底物的接觸點(diǎn)已被酶所飽和，繼續(xù)增加酶用量，酶的作用受到抑制;可能因?yàn)檫^(guò)量的酶包裹在血柚皮粒子表面阻礙黃酮類(lèi)物質(zhì)透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入水溶液而使其提取率下降．因此較佳的酶用量為0.6%．

2.1.2 酶解pH值對(duì)血柚皮總黃酮提取率的影響

酶是具有兩性電解質(zhì)的一種蛋白質(zhì)，酶分子依靠酸性或堿性氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)而形成活性部位，pH值的變化將直接影響到酶的活化以及酶與底物的親和力．

在酶用量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%，酶解溫度55℃，酶解時(shí)間60 min的條件下，考察溶液pH值對(duì)血柚皮中總黃酮提取率的影響，其結(jié)果見(jiàn)圖2．

圖2 酶解pH值對(duì)總黃酮提取率的影響Fig．2 Effect of pH on extraction efficiency of total flavonoids

從圖2中可以看出，隨著pH值的升高，總黃酮提取率增加，當(dāng)pH值達(dá)到5.5時(shí)，提取率達(dá)到最大，繼續(xù)增大pH值，總黃酮提取率卻急劇下降．這是因?yàn)楫?dāng)pH值小于5.5時(shí)，溶液中酸性太強(qiáng)，纖維酶的活性較低，總黃酮提取率較小;當(dāng)pH值處于5.5時(shí)，纖維素酶處于較佳pH值狀態(tài)，能夠發(fā)揮纖維素酶的最大活力，使得總黃酮提取率達(dá)到最大;當(dāng)pH值大于6之后，總黃酮提取率急劇下降，這是因?yàn)槊阜肿釉趐H值大于6后，可能會(huì)引起酶空間結(jié)構(gòu)的破壞，而引起酶的變性，使得底物不能與酶結(jié)合，使酶活力下降，導(dǎo)致總黃酮的提取率下降．因此，較佳的pH值為5.5．

2.1.3 酶解溫度對(duì)血柚皮總黃酮提取率的影響

在酶用量0.6%，pH 5.5，酶解時(shí)間60 min的條件下，考察酶解溫度對(duì)血柚皮中總黃酮提取率的影響，其結(jié)果見(jiàn)圖3．

圖3 酶解溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig．3 Effect of hydrolysis temperature on extraction efficiency of total flavonoids

從圖3中可以看出，隨著溫度的升高，酶的活性增大，總黃酮的提取率也增大，但當(dāng)溫度超過(guò)55℃時(shí)，總黃酮提取率卻急劇下降，這是因?yàn)闇囟容^低時(shí)，酶的活性隨著溫度的升高而增大，反應(yīng)速率增大，使得總黃酮提取率增大，當(dāng)溫度超過(guò)55℃時(shí)，可能會(huì)使酶蛋白結(jié)構(gòu)開(kāi)始變化，酶活性減弱，并逐漸喪失催化能力，使得總黃酮提取率下降．因此適宜的酶解溫度為55℃．

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)血柚皮總黃酮提取率的影響

在酶用量0.6%，pH 5.5，酶解溫度55℃的條件下，考察酶解時(shí)間對(duì)血柚皮總黃酮提取率的影響，其結(jié)果見(jiàn)圖4．

圖4 酶解時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig．4 Effect of length of hydrolysis time on extraction efficiency of total flavonoids

從圖4中可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮提取率增大，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最大，繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，總黃酮提取率反而下降．這是因?yàn)槊附鈺r(shí)間太短時(shí)，酶活力尚未充分利用，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解反應(yīng)比較完全，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)，血柚皮中的總黃酮幾乎溶出;繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，提取率不再增加，且時(shí)間過(guò)長(zhǎng)容易導(dǎo)致黃酮類(lèi)物質(zhì)不穩(wěn)定發(fā)生分解或者轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)．因此適宜的提取時(shí)間為60 min．

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)選血柚皮總黃酮提取工藝

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用L16(45)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，以酶用量、pH值、酶解溫度、酶解時(shí)間為試驗(yàn)因素，每個(gè)因素取4水平進(jìn)行優(yōu)選，以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，并進(jìn)行極差分析確定酶解法提取血柚皮中總黃酮的優(yōu)選工藝參數(shù)，其結(jié)果見(jiàn)表1～3．

表1 正交試驗(yàn)因素水平表L16(45)Tab．1 Factor levels of orthogonal experiments L16(45)

由表2的極差可知，影響纖維素酶水解法提取血柚皮中總黃酮的工藝中各影響因素的主次為:B＞A＞C＞D，即pH值＞酶用量＞酶解溫度＞酶解時(shí)間，優(yōu)選工藝為B4A2C4D2．將正交結(jié)果進(jìn)一步進(jìn)行方差分析如表3，從表3中方差分析可以看出，pH值和酶解溫度均有極顯著差異(F0＞F0.01)，而酶用量和酶解時(shí)間差異顯著(F0.05≤F0＜F0.01)．

2.3 正交試驗(yàn)各處理間的多重比較

2.3.1 酶用量各水平間差異顯著性的SSR檢驗(yàn)

酶用量各水平間差異顯著性SSR檢驗(yàn)參見(jiàn)表4．

從表4的SSR檢驗(yàn)可以看出，酶用量水平2與水平3和水平1存在顯著性差異(P＜0.05)，而與水平4之間存在極顯著差異(P＜0.01)．水平3和水平1之間不存在顯著性差異(P＞0.05)，但與水平4存在極顯著性差異(P＜0.01)，水平1和水平4之間存在著顯著性差異(P＜0.05)．所以較佳的酶用量為0.55%，其次為0.5%和0.6%，而0.65%不合適．

表2 總黃酮提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果Tab．2 Orthogonal array design matrix and results

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Tab．3 Variance analysis for orthogonal array design experimental results

表4 酶用量各水平間差異顯著性檢驗(yàn)Tab．4 Notability difference in enzyme concentration with statistic method of SSR

2.3.2 pH值各水平間差異顯著性的SSR檢驗(yàn)

pH值各水平間差異顯著性SSR檢驗(yàn)參見(jiàn)表5．

表5 pH各水平間差異顯著性檢驗(yàn)Tab．5 Notability difference pH with statistic method of SSR

從表5的SSR檢驗(yàn)可以看出，pH值水平4與水平3不存在顯著性差異(P＞0.05)，而水平4和水平2存在顯著性差異(P＜0.05)，與水平1存在極顯著性差異(P＜0.01)．水平3和水平2不存在顯著性差異(P＞0.05)，但與水平1存在極顯著性差異(P＜0.01)，水平2與水平1存在極顯著差異(P＜0.01)．所以較佳的pH值為5.2和5.5，其次是5.8，而pH=6.0不合適．

2.3.3 酶解溫度各水平間差異顯著性檢驗(yàn)

酶解溫度各水平間差異顯著性的SSR檢驗(yàn)參見(jiàn)表6．

表6 酶解溫度各水平間差異顯著性檢驗(yàn)Tab．6 Notability difference in hydrolysis temperature with statistic method of SSR

從表6的SSR檢驗(yàn)可以看出，酶解溫度水平4與水平3不存在顯著性差異(P＞0.05)，而與水平1和水平2存在極顯著性差異(P＜0.01)．水平3與水平1存在顯著性差異(P＜0.05)，而與水平2存在極顯著性差異(P＜0.01)．水平1與水平2之間不存在顯著性差異(P＞0.05)．所以較佳的酶解溫度為52℃和55℃，而58℃和60℃不適合．由于酶解溫度52℃和55℃不存在差異，從能源節(jié)約方面考慮，可將酶解溫度參數(shù)修正為52℃．

2.3.4 酶解時(shí)間各水平間差異顯著性的SSR檢驗(yàn)

酶解時(shí)間各水平間差異顯著性的SSR檢驗(yàn)參見(jiàn)表7.

表7 酶解時(shí)間各水平間差異顯著性檢驗(yàn)Tab．7 Notability difference of length of hydrolysis time with statistic method of SSR

從表7的SSR檢驗(yàn)可以看出，酶解時(shí)間水平2和水平1不存在顯著性差異(P＞0.05)，水平2與水平3存在顯著性差異(P＜0.05)，而與水平4存在極顯著性差異(P＜0.01)，水平1與水平3和水平4存在顯著性差異(P＜0.05)．水平3與水平4不存在顯著性差異(P＞0.05)．所以較佳的酶解時(shí)間為55 min和50 min，60 min和65 min不合適．由于酶解時(shí)間55 min和50 min不存在差異，從生產(chǎn)時(shí)間成本考慮，可將酶解時(shí)間參數(shù)修正為50 min．

2.4 驗(yàn)證結(jié)果

取一定量的血柚皮樣品，根據(jù)正交極差法得到的較佳工藝條件和修正后的較佳工藝做3組平行實(shí)驗(yàn)，總黃酮的提取率測(cè)定如表8．

表8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證Tab．8 Experiment of best condition

從表8中可以看出，最佳的酶提取條件所測(cè)得的總黃酮提取率均大于正交設(shè)計(jì)表中其他提取條件下總黃酮的提取率，且提取條件修正對(duì)提取結(jié)果不會(huì)產(chǎn)生影響．

3 結(jié)論

采用纖維素酶處理血柚皮，并提取血柚皮中的總黃酮，考察了酶用量、酶解pH值、酶解溫度、酶解時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響．通過(guò)正交試驗(yàn)，優(yōu)選出提取血柚皮總黃酮的較佳工藝條件為B4A2C4D2，即為酶解pH 5.2，酶用量0.55%，酶解溫度52℃，酶解時(shí)間55 min．方差分析顯示，酶解pH值和酶解溫度均有極顯著差異(F0＞F0.01)，而酶用量和酶解時(shí)間顯著差異(F0.05≤F0＜F0.01)．通過(guò)正交試驗(yàn)各因素間的多重比較，表明較佳工藝參數(shù)為酶解pH 5.2，酶用量0.55%，酶解溫度52℃，酶解時(shí)間50 min．通過(guò)驗(yàn)證較佳提取工藝B4A2C4D2和修正后的工藝B4A2C4D1的總黃酮提取率實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，且總黃酮提取率均大于正交設(shè)計(jì)表中其他提取條件下總黃酮的提取率，該工藝可用于血柚皮中總黃酮的提取．

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(責(zé)任編輯:檀彩蓮)

Extraction of Total Flavonoids from Blood Pummelo Peel by Cellulase Hydrolysis

CHEN Wen-juan1，CHEN Jian-fu2
(1．Department of Biological and Environmental Engineering，Zhangzhou City University，Zhangzhou 363000，China;(2．Department of Food and Biology Engineering，Zhangzhou Institute of Technology，Zhangzhou 363000，China)

The total flavonoids from blood pummelo peel was prepared by cellulose enzyme hydrolysis，and the extraction yield was measured by coloration method with aluminum nitrate．The effects of parameters including enzyme concentration，pH，hydrolysis temperature and hydrolysis time on extraction yield were investigated by single factor test and orthogonal array design methods．And the notability difference was analyzed with the statistic method of range and variance．The results showed that the optimal conditions were as follows:the enzyme concentration was 5.5%，pH was 5.2，hydrolysis temperature was 52℃，and the hydrolysis time was 50 min．The extraction yield of the total flavonoids from blood pummelo peel reached up to 1．52%．

blood pummelo peel;total flavanoids;cellulase

TS201.2;R284.2

A

1671-1513(2012)05-0032-06

2012-05-15

福建省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(JB11310)．

陳文娟，女，助教，碩士，主要從事食品科學(xué)與工程方面的研究;

陳建福，男，講師，博士，主要從事食品與生物工程方面的研究．通訊作者．