食品中磺胺類藥物化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的初步研究

萬宇平， 吳 鵬， 馮月君， 羅曉琴， 韓京朋

(北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206)

食品中磺胺類藥物化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的初步研究

萬宇平， 吳 鵬， 馮月君， 羅曉琴， 韓京朋

(北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206)

在常規(guī)酶聯(lián)免疫法的基礎(chǔ)上，將磺胺類母核與牛血清白蛋白合成免疫抗原后免疫小鼠制得磺胺類單克隆抗體，并進(jìn)一步優(yōu)化抗體工作濃度、反應(yīng)時(shí)間等實(shí)驗(yàn)參數(shù)，建立了一種簡(jiǎn)便、快速、精確的磺胺類殘留一步式化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法.結(jié)果表明該方法最佳檢測(cè)范圍為1.0～81.0 ng/mL，檢測(cè)IC50達(dá)3.047 ng/mL，對(duì)豬肉的最低檢測(cè)限為0.74 ng/g，可檢出國(guó)際規(guī)定的SAs殘留標(biāo)準(zhǔn)底限值以下的殘留量.與常規(guī)ELISA方法相比，檢測(cè)限和靈敏度基本一致，但反應(yīng)時(shí)間縮短了60 min.證明采用一步式化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)磺胺類殘留可以大幅度縮減檢測(cè)時(shí)間，符合快速檢測(cè)的要求.

獸藥;檢測(cè)技術(shù);磺胺類;化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法;試劑盒

磺胺類藥物(sulfonamides，SAs)的基本結(jié)構(gòu)為對(duì)氨基苯磺酰胺，具有芳氨基和磺酞胺基，多為兩性化合物，藥物具有一定酸性［1］.磺胺類藥物的抑菌作用機(jī)理是磺胺類藥物中能分解出對(duì)氨基苯磺酰胺，其分子的大小和形狀與組成葉酸中的對(duì)氨基苯甲酸相近，化學(xué)性質(zhì)也類似.由于細(xì)菌對(duì)二者缺乏選擇性，大量的對(duì)氨基苯磺胺替代了對(duì)氨基苯甲酸而被細(xì)菌吸收，干擾細(xì)菌葉酸的合成而影響其生長(zhǎng)繁殖，從而可抑制大多數(shù)革蘭氏陽性菌和某些陰性菌.磺胺類藥物應(yīng)用較廣，具有一定療效的就有幾十種［2］.

磺胺類藥物在動(dòng)物疾病的防治方面具有顯著的療效，例:針對(duì)動(dòng)物的腸炎、乳房炎、肺炎、腦膜炎等疾病.因此磺胺類藥物作為獸藥和飼料添加劑，在食源性動(dòng)物的飼養(yǎng)中被廣泛應(yīng)用［3］.同時(shí)，這類藥物具有顯著的毒副作用，影響人的泌尿系統(tǒng)功能，引起結(jié)晶尿、血尿、尿痛、尿少等癥狀，或產(chǎn)生一些皮炎、發(fā)熱等過敏反應(yīng)以及致癌性作用［4－5］.如果這類藥物不按規(guī)定或要求使用與停藥，動(dòng)物體內(nèi)的藥物殘留會(huì)隨著食物鏈最終蓄積在人體內(nèi)，從而影響人體的健康［6］.因此，國(guó)內(nèi)外對(duì)磺胺類藥物殘留均有限量要求，我國(guó)以及美國(guó)、歐盟等國(guó)家規(guī)定動(dòng)物性食品中總磺胺以及單個(gè)磺胺的最高殘留限量(maximum residue limit，MRL)為 0.1 mg/kg，其中磺胺二甲基嘧啶(SM2)的 MRL 為 0.025 mg/kg［7］.

目前，針對(duì)磺胺類獸藥殘留的檢測(cè)方法有薄層色譜(thin-layer chromatography，TLC)、高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法、液質(zhì)聯(lián)用(high performance liquid chromatography/mass spectrum，HPLC/MS)、氣相色譜(gas chromatography，GC)、酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunoassay，ELISA)和毛細(xì)管電泳(high performance capillary electrophoresis，HPCE) 法等［8－13］.由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的前處理過程，儀器分析方法不適合現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本的篩選，其中ELISA方法作為一種新型的動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物殘留篩選方法已被使用，并且ELISA法在穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度方面存在著一定的局限性，大部分只能針對(duì)磺胺類其中一種或者少數(shù)幾種藥物進(jìn)行檢測(cè)，不利于磺胺類藥物的全面檢測(cè)［14－17］.

化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定快速、檢測(cè)范圍寬、操作簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高、試劑穩(wěn)定且有效期長(zhǎng)(6～18個(gè)月)等優(yōu)點(diǎn)，其檢測(cè)限比酶聯(lián)免疫法和理化檢測(cè)方法高幾個(gè)數(shù)量級(jí)［18－19］.化學(xué)發(fā)光進(jìn)口儀器與試劑性能較好，而國(guó)外的技術(shù)壟斷導(dǎo)致化學(xué)發(fā)光儀、發(fā)光底物液和試劑盒價(jià)格居高不下，而且試劑或試劑盒與儀器相匹配，進(jìn)口試劑常常不能在國(guó)產(chǎn)儀器中使用，造成化學(xué)發(fā)光免疫方法無法在基層普及.化學(xué)發(fā)光底物液是化學(xué)發(fā)光酶免疫檢測(cè)方法的關(guān)鍵試劑，配制出低成本且性能良好，適合國(guó)產(chǎn)儀器使用的的發(fā)光底物液，可降低化學(xué)發(fā)光方法的使用成本，有利于在基層的普及.建立穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法，是進(jìn)行化學(xué)發(fā)光試劑盒的研制的基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)于嚴(yán)把食品安全的檢驗(yàn)環(huán)節(jié)有重要的意義.

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

2000SBL型電子天平，美國(guó)Setra公司;90-2型磁力攪拌器，上海振榮科學(xué)儀器有限公司;微量移液器，單道20 ～200 μL、100 ～1 000 μL，多道 50 ～300 μL，美國(guó)Thermo公司;DSY-Ⅲ型氮吹儀，北京金科精華苑科技有限公司;QL-901型漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司;Anke TDL-40B型低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器有限公司;CentroLB960型微孔板式發(fā)光儀，德國(guó)Berthold公司;Opti-plateTM型化學(xué)發(fā)光板，Perkin Elmer公司;DHP-600型生化培養(yǎng)箱，天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司.

1.2 材料與試劑

魯米諾、三(羥甲基)氨基甲烷，Sigma公司;磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，德國(guó)Dr.Ehrenstorfe公司;牛血清白蛋白BSA、卵清蛋白OVA，Sigma公司;乙酸乙酯、三乙胺、柱層析、6-氨基煙酸、柱層析、6-氨基煙酸乙酯、4-乙酰氨基苯磺酰氯、二氯乙烷、二甲基甲酰胺，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，美國(guó)Jackson公司;弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，北京望爾生物技術(shù)有限公司;其他有關(guān)化學(xué)試劑均為分析純.

1.3 其他試劑制備

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液

以常規(guī)方法將磺胺類藥物純品用含有10%甲醇的0.05 mmol/L，pH=7.4的PBS配制成濃度分別為 0.0，1.0，3.0，9.0，27.0，81.0 ng/mL 的磺胺類標(biāo)準(zhǔn)溶液，所屬百分比為體積百分比.

1.3.2 酶標(biāo)二抗

用洗滌溶液按照1∶2 000的體積比將辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗鼠IgG配制成酶標(biāo)二抗工作液.

1.3.3 抗體工作液

磺胺類單克隆抗體是用人工免疫抗原免疫動(dòng)物制得的單克隆抗體，將所得磺胺類單克隆抗體用洗滌溶液稀釋成1∶64 000的工作濃度.

1.3.4 魯米諾化學(xué)發(fā)光溶液

A液為魯米諾含量為0.01 M、對(duì)甲苯酚含量為0.001 M pH=8.8的三(羥甲基)氨基甲烷溶液;B液為100 mL溶液含檸檬酸2.1 g，無水 Na2HPO42.82 g，0.75%的過氧化氫脲0.64 mL的溶液.

1.3.5 濃縮復(fù)溶液

NaH2PO4·2H2O 5.74 g、Na2HPO4·12H2O 32.6 g溶于1 L去離子水中.

1.3.6 濃縮洗滌液

按體積分?jǐn)?shù)0.05%將吐溫－20添加至pH=7.4，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中.

2 試劑盒組成及其制備

2.1 試劑盒組成

磺胺類化學(xué)發(fā)光試劑盒包括:96孔化學(xué)發(fā)光板1塊(包被有偶聯(lián)抗原);標(biāo)準(zhǔn)液6瓶(1 mL/瓶):0.0，1.0，3.0，9.0，27.0，81.0 ng/mL;高濃度標(biāo)準(zhǔn)品(1 mL/瓶):1 μg/mL;酶標(biāo)二抗1 mL;抗體工作液7 mL;魯米諾化學(xué)發(fā)光液A液6 mL、B液6 mL;20倍濃縮洗滌液40 mL;2倍濃縮復(fù)溶液50 mL.

2.2 抗原的合成

2.2.1 母核半抗原合成

于25 mL單口瓶中加入6-氨基煙酸0.87 g，乙醇20 mL，鹽酸(12 mol/L)3.7 mL，加熱回流，反應(yīng)8 h，薄層色譜法(thin-layer chromatography，TLC)監(jiān)測(cè)，反應(yīng)完畢，減壓除去溶劑，溶于飽和NaHCO3水溶液，乙酸乙酯萃取，無水Na2SO4干燥，柱層析(乙酸乙酯/石油醚，2/1，v/v)純化.于25 mL單口瓶中加入6-氨基煙酸乙酯0.89 g，三乙胺(Et3N)1.6 mL，CH2Cl210 mL，攪拌溶解后，加入催化量4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine，DMAP).緩慢滴入含1.57 g 4-乙酰氨基苯磺酰氯的2 mL二氯甲烷溶液，TLC監(jiān)測(cè)，5 h，反應(yīng)完畢，10 mL水洗3次，飽和食鹽水洗一次，干燥，柱層析純化(乙酸乙酯/石油醚，1/10，v/v).于25 mL單口瓶中加入上述產(chǎn)物1 g，2 mol/L NaOH水溶液120 mL，加熱回流，TLC監(jiān)測(cè)，反應(yīng)10 h，反應(yīng)完畢，調(diào)節(jié)pH值4～5，有固體析出，得到磺胺母核半抗原.

2.2.2 免疫原(SAs-BSA)合成

取12 mg磺胺類半抗原，溶解于1 mL二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)中，冷卻至10℃，取15 mg二氯乙烷(dichloroethane，EDC)用0.2 mL水充分溶解后加入冷卻好的磺胺類半抗原DMF溶液中，室溫下攪拌24 h，即可得到反應(yīng)液A.稱取BSA 40 mg，使之充分溶解在3 mL PBS(pH 7.2)中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24 h，用0.01 mol/L PBS在4℃透析3 d，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì).分裝，于－20 ℃保存?zhèn)溆茫?0］.

2.2.3 包被原(SAs-OVA)的合成

稱取30 mg OVA和12 mg磺胺母核半抗原，按2.2.2步驟反應(yīng)，合成SAs-OVA，供包被用.

2.3 單克隆抗體的制備

用上述制備出的免疫原(SAs-BSA)按100 μg/只，以生理鹽水溶解免疫原與弗氏完全佐劑等體積混勻，頸背部皮下注射免疫6～8周齡Balb/c雌鼠，初次免疫后第7，14，28 d以免疫原與弗氏不完全佐劑等體積混勻，各追加免疫一次，融合前3 d以免疫復(fù)合物100 μg/只，不加弗氏佐劑再追加免疫一次.按常規(guī)方法進(jìn)行，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)混合，然后在45 s內(nèi)緩慢加入預(yù)熱的融合劑(PEG4000)進(jìn)行融合，用HAT培養(yǎng)基懸浮均勻，再加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后用HT培養(yǎng)基半換液，9 d時(shí)候進(jìn)行全換液，得到雜交瘤細(xì)胞，將2～3次亞克隆建株后的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，收集上清液用間接ELISA測(cè)定效價(jià)，凍存;并取8～10周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.5 mL/只，7～10 d后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞1～2×106/只，7～10 d后抽取小鼠腹水，離心取上清，測(cè)定效價(jià)，并凍存?zhèn)溆茫?1－22］.

2.4 磺胺類化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法的建立

2.4.1 酶標(biāo)板的制備

用包被緩沖液將磺胺類包被原稀釋成10 μg/mL，每孔加入100 μL，37 ℃溫育2 h，傾去包被液，然后在每孔中加入150 μL封閉液，37℃溫育2 h，傾去孔內(nèi)液體，用稀釋20倍的濃縮洗滌液洗滌1次，拍干.

2.4.2 確定抗原抗體最佳稀釋比例

采用方陣滴定法確定包被原與單克隆抗體的最佳工作濃度.將包被抗原按 160.0，80.0，40.0，20.0，10.0，5.0，2.5，1.25 μg/mL 的系列稀釋度包被酶標(biāo)板，將酶標(biāo)磺胺類單克隆抗體按1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000，1∶16 000，1∶32 000，1∶64 000，1∶128 000，1∶256 000 的倍數(shù)進(jìn)行稀釋，用常規(guī)ELISA方法，采用方陣法確定抗原抗體的最佳稀釋比例［23］.

2.4.3 磺胺類化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫方法標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線的繪制

向用磺胺類偶聯(lián)包被原包被的酶標(biāo)板微孔中加入濃度分別為 0.0，1.0，3.0，9.0，27.0，81.0 ng/mL的磺胺類標(biāo)準(zhǔn)品溶液各50 μL，每孔加入酶標(biāo)羊抗鼠抗體50 μL，再加入磺胺類單克隆抗體工作液50 μL，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜封板，25℃恒溫箱中反應(yīng)15 min，倒出孔中液體，重復(fù)洗板5次，拍干.每孔加入化學(xué)發(fā)光顯色液100 μL，輕輕振蕩混勻，3 min后用微孔板式發(fā)光儀測(cè)定每個(gè)孔的發(fā)光強(qiáng)度.每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的發(fā)光強(qiáng)度平均值(RLU)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的發(fā)光強(qiáng)度值(RLU0)再乘以100%，得到百分發(fā)光強(qiáng)度值，以磺胺類標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/mL)的對(duì)數(shù)值(lgC)為x軸，百分發(fā)光強(qiáng)度值為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖.

2.4.4 檢測(cè)與其他藥物的交叉反應(yīng)率

以磺胺甲氧異惡唑作為標(biāo)準(zhǔn)，按試劑盒程序操作，加入不同的磺胺類競(jìng)爭(zhēng)物和非磺胺類競(jìng)爭(zhēng)物，并以實(shí)驗(yàn)所得化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值，計(jì)算抑制百分比并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)線性方程計(jì)算各競(jìng)爭(zhēng)物50%抑制濃度(IC50).交叉反應(yīng)率(CR%)即為抗體對(duì)磺胺甲氧異惡唑的IC50與抗體對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物的IC50之比的百分?jǐn)?shù)，按式(1)進(jìn)行計(jì)算:

2.4.5 豬肉中磺胺類殘留檢測(cè)

稱取2.0±0.05 g均質(zhì)物至50 mL聚苯乙烯離心管中，加入200 μL 0.1 mol/L NaOH，再加入3.8 mL乙腈和2 mL乙酸乙酯，立即振搖3 min，4 000 r/min離心5 min;取3 mL上清液至10 mL干凈玻璃試管中，于50～60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈?加入1 mL正己烷，用渦旋儀渦動(dòng)30 s溶解干燥殘留物，加入1 mL磷酸鹽緩沖液，用渦旋儀渦動(dòng)10 s后轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，4 000 r/min，室溫(20～25℃)離心5 min;除去上層正己烷相，取下層水相50 μL用于分析.

2.4.6 最低檢測(cè)限

取20份不含磺胺類藥物的空白豬肉樣品，按照2.4.5步驟處理后所建立的ELISA方法進(jìn)行檢測(cè).通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算對(duì)應(yīng)的濃度.以20份空白樣品對(duì)應(yīng)的樣品濃度平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為樣本檢測(cè)的最低檢測(cè)限:

式(2)中:x為20份空白樣品的平均值，s為20份空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)差.

2.4.7 準(zhǔn)確度及精密度

取磺胺甲氧異惡唑標(biāo)準(zhǔn)品分別對(duì)豬肉樣品按照1.0 ng/g、2.0 ng/g進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn).分別抽取3個(gè)批次試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度做6個(gè)重復(fù)，每個(gè)樣品2個(gè)平行，計(jì)算準(zhǔn)確度及精密度.

2.4.8 試劑盒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取磺胺類藥物化學(xué)發(fā)光試劑盒用于穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的測(cè)定，分別放置－20℃冰箱和37℃溫箱6 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，比較放置前后各標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)光強(qiáng)度值變化.

3 結(jié)果

3.1 磺胺半抗原的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其TLC色譜

合成后的半抗原結(jié)構(gòu)圖如圖1.

圖1 磺胺類半抗原結(jié)構(gòu)Fig.1 SAs hapten chemical structure

從合成的半抗原TLC可以看出，在450 nm紫外燈下磺胺類藥物半抗原在薄層板上已經(jīng)呈現(xiàn)出規(guī)則的原點(diǎn)狀，并且無拖尾現(xiàn)象，證明合成的磺胺類半抗原的純度較高，如圖2.

半抗原分子中，左半邊結(jié)構(gòu)保持了磺胺類化合物的共有特征結(jié)構(gòu)，而因?yàn)榛前奉惢衔镉野脒叴蟛糠纸Y(jié)構(gòu)都是含N的雜環(huán)結(jié)構(gòu)，所以在半抗原右半邊引入帶羧基的吡啶環(huán)結(jié)構(gòu)，從而更易產(chǎn)生對(duì)大部分磺胺類化合物具有交叉反應(yīng)的抗體.

圖2 磺胺類半抗原薄層色譜圖Fig.2 SAs hapten thin-layer chromatograms

3.2 包被抗原及SAs單抗最佳稀釋倍數(shù)

經(jīng)方陣法實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)得到的0 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值(OD值)和1.0 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品OD值，計(jì)算抑制率，結(jié)果如表1.

對(duì)于酶標(biāo)儀，OD值在1～2時(shí)讀數(shù)的可信度較大，所以一般取OD值在1.5～2.0的孔所對(duì)應(yīng)的包被濃度為最佳包被濃度;另外為了試劑盒的靈敏度和準(zhǔn)確度考慮，一般控制抑制率在70% ～80%，從表1中可知，抗體、抗原包被濃度過大，OD值普遍偏高，另外抗體濃度大或包被濃度大，也是造成不必要的浪費(fèi).抗體濃度小或者抗原包被濃度太小，則造成整個(gè)板顯色偏低，當(dāng)抗原包被濃度為10 μg/mL，SAs單抗稀釋倍數(shù)為1∶64 000時(shí)，實(shí)驗(yàn)效果較理想(OD值在1.5～2.0，抑制率在70% ～80%)，因此，確定抗原包被濃度為10 μg/mL，SAs單抗的稀釋倍數(shù)為1∶64 000.

3.3 競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化

按上述實(shí)驗(yàn)方法加入標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)記抗體后測(cè)定室溫下反應(yīng)10，15，20，25 min后加入發(fā)光溶液，測(cè)定0標(biāo)準(zhǔn)品的發(fā)光值，結(jié)果表明在反應(yīng)15 min時(shí)，發(fā)光值最大，因此本試劑盒選取反應(yīng)時(shí)間為15 min.結(jié)果見圖3.

根據(jù)確定好的反應(yīng)模式和反應(yīng)時(shí)間，與常規(guī)EILSA方法進(jìn)行反應(yīng)時(shí)間比較，結(jié)果見表2.

從表2可以看出，化學(xué)發(fā)光試劑盒方法比常規(guī)ELISA方法節(jié)省時(shí)間至少47 min，最多可節(jié)省72 min.

3.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

以磺胺甲氧異惡唑標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，發(fā)光百分比(RLU/RLU0)為縱坐標(biāo)，繪制抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖4。

表1 抗原抗體最佳稀釋濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Antigen and monoclonal antibody diluted concentration testing

表2 化學(xué)發(fā)光試劑盒與ELISA試劑盒反應(yīng)時(shí)間比較Tab.2 Reaction time comparison of CLEIA kit and ELISA kit min

從圖4中可以看出，得到的曲線線性方程為y=－35.166x+69.165，線性相關(guān)系數(shù) R2=0.991 9，其中y為RLU值，x為磺胺甲氧異惡唑標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)數(shù).

將磺胺甲氧異惡唑濃度對(duì)數(shù)值用專業(yè)分析軟件替換為磺胺甲氧異惡唑濃度，制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用以分析樣品中磺胺類藥物殘留，所得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線見圖5.

由圖5得出IC50值為3.047 ng/mL，線性范圍為1.0～81.0 ng/mL.

圖3 反應(yīng)時(shí)間與發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系Fig.3 Relationship of reaction time and luminescent intensity

圖4 磺胺類試劑盒線性回歸方程及標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Equation of linear regression and standard curve of the SAs kit

圖5 磺胺類試劑盒標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.5 Standard working curve of SAs kit

3.5 試劑盒特異性

磺胺類單克隆抗體對(duì)其類似物的交叉反應(yīng)率見表3.

表3可見，該單克隆抗體對(duì)17種磺胺類藥物的交叉反應(yīng)率均較高，而對(duì)非磺胺類藥物基本無交叉反應(yīng)，所以該試劑盒適用于檢測(cè)17種磺胺類藥物的總殘留量.

3.6 最低檢測(cè)限

對(duì)20份不含磺胺類藥物的空白豬肉樣本進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差為該方法對(duì)實(shí)際樣本的最低檢測(cè)限，結(jié)果見表4.根據(jù)20份樣本的檢測(cè)結(jié)果，并利用公式計(jì)算，該試劑盒對(duì)豬肉樣本的最低檢測(cè)限為0.74 ng/g.

表3 磺胺類試劑盒特異性實(shí)驗(yàn)Tab.3 Specific testing of SAs kit

3.7 準(zhǔn)確度與精密度

ELSIA法的準(zhǔn)確度以回收率表示，精密度以變異系數(shù)來表示.取豬肉樣本分別添加磺胺甲氧異惡唑標(biāo)準(zhǔn)品至1.0 ng/g和2.0 ng/g，對(duì)樣本進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，分別計(jì)算準(zhǔn)確度和精密度，檢測(cè)結(jié)果見表5.

從表5可知，試劑盒對(duì)豬肉樣本的添加回收率在70% ～100%，批內(nèi)變異系數(shù)在10.4% ～14.1%，批間變異系數(shù)在11.7%～12.2%.

表4 該方法對(duì)豬肉的最低檢測(cè)限Tab.4 Lowest detection limit of method for pork ng/g

表5 準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of accuracy and precision testing

3.8 試劑盒穩(wěn)定性

試劑盒分別放置于－20℃冰箱和37℃溫箱6 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，比較放置前與放置后參考標(biāo)準(zhǔn)品各點(diǎn)RLU值，參考標(biāo)準(zhǔn)品各點(diǎn)RLU值未見明顯降低，且本底發(fā)光值無明顯升高，表明試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線無明顯漂移，滿足穩(wěn)定性要求.在實(shí)際應(yīng)用中，試劑盒一般存放在2～8℃冰箱，所以對(duì)于整體試劑盒的穩(wěn)定性評(píng)判，還需要進(jìn)行2～8℃放置保存實(shí)驗(yàn)，從而進(jìn)一步驗(yàn)證試劑盒的穩(wěn)定性.

4 結(jié)論

由于磺胺類藥物是小分子物質(zhì)，沒有免疫原性，所以必須連接到大分子載體上產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，本實(shí)驗(yàn)將磺胺類藥物的母核分別與牛血清白蛋白和卵清蛋白偶聯(lián)，合成免疫原和包被原.本研究根據(jù)間接競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)原理建立快速檢測(cè)SAs的一步式CLEIA，經(jīng)進(jìn)一步優(yōu)化，其最佳反應(yīng)條件為:抗原包被濃度為10 μg/mL，包被溫度為37℃，反應(yīng)2 h，SAs單抗最佳稀釋倍數(shù)為1∶64 000，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)15 min，洗滌液為pH 7.4、含0.05%吐溫 －20的 PBST溶液.本研究所制備的單克隆抗體對(duì)磺胺類藥物具有很高的特異性(IC50=3.047 ng/mL)，并且對(duì)磺胺類藥物抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，對(duì)17種磺胺類藥物類似物的交叉反應(yīng)率較高，而對(duì)其他非磺胺類藥物無交叉反應(yīng)，該試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為1.0～81.0 ng/mL，IC50為 3.047 ng/mL，對(duì)豬肉的最低檢測(cè)限為0.74 ng/g，樣本添加回收率在70.0% ～100.0%，批內(nèi)變異系數(shù)在10.4% ～14.1%，批間變異系數(shù)在11.7%～12.2%.

我國(guó)規(guī)定，磺胺類藥物在食品中的殘留限量為所有食品動(dòng)物肌肉、動(dòng)物肝、牛奶 100 mg/kg［24］，本實(shí)驗(yàn)方法的各項(xiàng)指標(biāo)均能滿足檢測(cè)要求.經(jīng)檢驗(yàn)，與常規(guī)一步式或兩步式ELISA的檢測(cè)效果基本一致，且可縮短反應(yīng)時(shí)間約60 min.可見，以一步式CLEIA檢測(cè)動(dòng)物組織中得SAs殘留更符合快速檢測(cè)的要求，實(shí)現(xiàn)了對(duì)SAs殘留的簡(jiǎn)便、快速、精確檢測(cè).

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(責(zé)任編輯:李 寧)

Preliminary Study on Chemiluminescent Enzyme Immunoassay Kit for Sulfonamides in Food

WAN Yu-ping， WU Peng， FENG Yue-jun， LUO Xiao-qin， HAN Jing-peng
(Beijing Kwinbon Biotechnology Co.Ltd.，Beijing 102206，China)

Based on conventional enzyme linked immunoassay(ELISA)，a convenient，rapid and accurate one-step sulfonamides(SAs)residue chemiluminescent enzyme immunoassay(CLEIA)detection method was established through obtaining monoclonal antibodies from immunizing mice which was injected with SAs-BSA coupling protein，and optimizing test parameters such as antibody concentration，reaction time.The results showed that the best detection range of this method was 1.0～81.0 ng/mL，the IC50was 3.047 ng/mL，the detection limit was 0.74 ng/mL.Compared with conventional ELISA，the CLEIA method can not only increase the detection limit and sensitivity，but also shorten the reaction time by 60 minutes.CLEIA kit is more appropriate for rapid detection of the SAs residue in food.

veterinary medicine;detection techniques;sulfonamides;chemiluminescent enzyme immunoassay;kit

TS201.6

A

1671-1513(2012)02-0027-08

2011-10-24

萬宇平，男，北京勤邦生物技術(shù)有限公司副總經(jīng)理兼研發(fā)總監(jiān)，主要從事食品安全快速檢測(cè)技術(shù)方面的研究.