左卡尼汀對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠心肌肥厚的保護(hù)作用及機(jī)制研究

姚秀云，楊育紅，宋 瑩，王洪新，張 晶，李洪秀

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000;2.遼寧省盤錦市第二醫(yī)院，遼寧 盤 錦 124000)

心肌肥厚(myocardial hypertrophy，MH)是心血管疾病患者發(fā)病率和死亡率增加的一個(gè)重要原因，心肌肥厚最終發(fā)展成心衰。左卡尼汀(L-carnitine)又稱左旋肉堿，是哺乳動(dòng)物能量代謝必需的體內(nèi)天然物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞中能量的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)運(yùn)起重要作用。L-carnitine能促進(jìn)脂肪酸經(jīng)β-氧化進(jìn)人三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量，與機(jī)體的器官、組織代謝密切相關(guān)［1］。L-carnitine的缺乏會(huì)導(dǎo)致能量供應(yīng)障礙及脂肪酸代謝的各種中間產(chǎn)物累積酸中毒，出現(xiàn)心肌病變、心律失常、機(jī)體疲勞等癥狀［2］。一般認(rèn)為在缺血、缺氧時(shí)，心肌細(xì)胞內(nèi)脂肪酸β-氧化障礙，脂肪酸堆積，葡萄糖酵解增強(qiáng)，腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)水平下降，線粒體膜結(jié)構(gòu)改變，線粒體膜相崩解而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。另有研究表明L-carnitine通過線粒體外膜上的卡尼丁脂酰轉(zhuǎn)移酶I和內(nèi)膜內(nèi)側(cè)的卡尼丁脂酰轉(zhuǎn)移酶Ⅱ作用，促使脂肪酸進(jìn)一步分解。L-carnitine能調(diào)節(jié)乙酰輔酶A/脂酰輔酶A的比值，從而激活丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的活性，促進(jìn)葡萄糖的代謝［3］。臨床應(yīng)用L-carnitine輔助治療冠心病、心絞痛、心肌梗死合并心源性休克均具有一定療效，但是應(yīng)用L-carnitine在心肌肥厚及能量代謝方面的研究尚未見報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)采用異丙腎上腺素(Isoproterenol，Iso)誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚模型，觀察L-carnitine對(duì)心肌肥厚及反映線粒體功能的線粒體膜電位的影響，初步探討L-carnitine改善心肌肥厚后在能量代謝方面的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物、主要儀器與試劑 L-carnitine:沈陽東宇精細(xì)化工廠，批號(hào):101101，純度98%。乳酸LAC測(cè)定試劑盒、游離脂肪酸FFA測(cè)定試劑盒、總蛋白測(cè)定試劑盒(考馬斯亮藍(lán)法)、羥脯氨酸測(cè)定試劑盒:南京建成生物工程研究所。線粒體膜電位Jc-1試劑盒:江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。激光掃描共聚焦顯微鏡(Leica sp5，德國Leica)

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、模型制備及分組 清潔級(jí)，SD大鼠，♀♂各半40只，體質(zhì)量180～200 g，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(遼)2003-0007。

大鼠隨機(jī)分為4組，每組♀♂各5只。① Iso組:按Rona等［4］方法略作修改，皮下注射(sc)Iso，以20、10 和 5 mg·kg－1·d－1劑量遞減 3 d，再以 3 mg·kg－1·d－1連續(xù) 7 d，每天腹腔注射蒸餾水 2 ml·kg－1;②空白組:以等量生理鹽水代替Iso處理，并以等量蒸餾水腹腔注射;③ L-carnitine組:sc Iso同時(shí)給予 L-carnitine，按 100 mg·kg－1劑量腹腔注射每天1次;④ Propranolol組:sc Iso同時(shí)給Propranolol，按50 mg·kg－1劑量腹腔注射每天1次。各組均持續(xù)8周，標(biāo)準(zhǔn)飲食飲水。術(shù)后正常飲食，定期觀察生長狀態(tài)。

1.3 測(cè)定心肌肥厚的指數(shù) 麻醉開胸，取心臟，稱全心濕重(heart wet weight，HW)及左心室濕重(left ventricle wet weight，LVW)，計(jì)算心臟質(zhì)量指數(shù)(heart mass index，HMI=HW/BW，mg·kg－1)和左室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index，LVMI=LWH/BW，mg·g－1)。

1.4 測(cè)定心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo) 4組大鼠于停藥24 h后稱體重(body weight，BW)，腹腔注射20%烏拉坦(5 ml·kg－1·d－1)麻醉。于頸部偏右側(cè)開縱行切口，分離右頸總動(dòng)脈，經(jīng)右頸總動(dòng)脈插入聚乙烯導(dǎo)管，用Pclab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)，導(dǎo)管插入3～3.5 cm即可進(jìn)入左心室，穩(wěn)定5 min后測(cè)定大鼠心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)及左室壓力變化最大速率(±dp/dtmax)。

1.5 Masson染色檢查心肌組織改變 取心尖組織迅速固定于10%甲醛中，常規(guī)石蠟包埋，制備石蠟切片，石蠟橫斷面連續(xù)切片5～6片，厚度約5 μm。切片常規(guī)脫蠟脫水，行Masson染色，光鏡下做常規(guī)觀察。

1.6 測(cè)定心肌生化指標(biāo) 取心尖組織100 mg，置入含0.9%生理鹽水0.9 ml的試管中，用勻漿器勻漿，得到組織勻漿。按試劑盒方法考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定心肌總蛋白，測(cè)定心肌羥脯氨酸(hydroxyproline，Hpy)游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)、乳酸(lactic acid，LAC)含量。

1.7 心肌細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的測(cè)定 按照文獻(xiàn)［5－6］的方法制備肥厚心肌的單個(gè)心室肌細(xì)胞，取(1～6)×105細(xì)胞，重懸于 0.5 ml KB 液(mmol·L－1:L-谷氨酸70，牛磺酸 20，KCl 40，EGTA 0.5，KH2PO420，MgCl23，D-glucose 10，HEPES 10，KOH 70)中保存。加入JC-1染色工作液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min。用JC-1染色緩沖液洗滌2次，再用適量JC-1染色緩沖液重懸。在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以產(chǎn)生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)JC-1單體時(shí)把激發(fā)光設(shè)置為490 nm，發(fā)射光設(shè)置為530 nm得到紅色熒光圖像;檢測(cè)JC-1聚合物時(shí)，把激發(fā)光設(shè)置為525 nm，發(fā)射光設(shè)置為590 nm觀察得到綠色熒光圖像，此兩通道重疊得到橘色圖像，并測(cè)得熒光強(qiáng)度。隨機(jī)選擇20個(gè)視野，每個(gè)視野約測(cè)4個(gè)細(xì)胞。通過對(duì)紅色和綠色熒光強(qiáng)度的比值計(jì)算出MMP的相對(duì)數(shù)值。

2 結(jié)果

2.1 L-carnitine對(duì)心肌肥厚大鼠心臟指數(shù)的影響

Iso連續(xù)注射10 d可引起大鼠HMI和LVMI兩指數(shù)增加50.2%和63.1%;L-carnitine和普萘洛爾能降低注射Iso后大鼠的HMI和LVMI，P＜0.01，而與空白組比較，差異無顯著性(見Fig 1)。

Fig 1 Effect of L-carnitine on heart mass index(HMI)and left ventricular mass index(LVMI)in myocardial hypertrophy induced by Isoproterenol(Iso)in rats(±s，n=8)

2.2 L-carnitine對(duì)心肌肥厚大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響 Iso連續(xù)注射10 d可引起大鼠－dp/dtmax和LVEDP高于空白組36%和50%，+dp/dtmax和LVSP也有所增加;L-carnitine和Propranolol能改善注射Iso后大鼠工作心臟的－dp/dtmax和LVEDP，分別降低了33.8%和21.4%(P＜0.01)(Tab 1)。

2.3 L-carnitine處理后心肌組織病理學(xué)觀察 大體觀察見Iso組大鼠心臟體積較空白組明顯增大，L-carnitine組和propranolol組大鼠心臟增大不明顯。光鏡下，空白組(A)心肌細(xì)胞未見明顯肥大及壞死，無膠原纖維增生;Iso組(B)見心肌細(xì)胞變大，有灶性壞死，大量膠原纖維增生呈大斑片狀，病理改變多位于心尖部心內(nèi)膜下層;L-carnitine組(C)和prop-ranolol組(D)可見心肌細(xì)胞肥大程度較Iso組減輕，心肌纖維排列整齊，偶有點(diǎn)片狀壞死，膠原纖維增生較少(Fig 2)。

Tab 1 Effects of L-carnitine on hemodynamic parameters in myocardial hypertrophy induced by Isoproterenol(Iso)in rats(±s，n=8)

Tab 1 Effects of L-carnitine on hemodynamic parameters in myocardial hypertrophy induced by Isoproterenol(Iso)in rats(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs Iso group

Group LVSP/kPa LVEDP/kPa+dp/dtmax/kPa·s－1－dp/dtmax/kPa·s －1 Control 13.9 ±1.1 5.5 ±0.9 1056 ±46 985 ±70 Iso 16.3±1.5＊＊ 8.4±1.3＊＊ 751±61＊＊ 628±57＊＊L-carnitine 15.2 ±0.9# 6.6 ±0.5## 862 ±75# 840 ±69##Propranolol14.9 ±0.9## 6.5 ±0.5## 891 ±81## 866 ±90##

Fig 2 Effect of L-carnitine on myocardial tissue pathogenic changes of myocardial hypertrophy induced by Isoproterenol(Iso)in rats

2.4 L-carnitine對(duì)大鼠左心室肌組織LD和FFA含量和Hpy的影響 Iso組HPY、LAC和FFA含量高于空白組53.7%、23.1%和30.2%，L-carnitine和Propranolol能降低注射Iso后大鼠的這3項(xiàng)指標(biāo)，各自降低了15.8%、14.5%和16.9%，但 L-carnitine組在Hpy上與空白組還是有差異，propranolol組在FFA上與空白組有差異。表明L-carnitine可以降低心肌的Hpy含量，防止膠原沉積;降低心肌FFA和LAC含量，防止其在細(xì)胞中的堆積(Tab 2)。

2.5 L-carnitine對(duì)心肌細(xì)胞線粒體膜電位影響通過對(duì)紅色和綠色熒光強(qiáng)度的比值計(jì)算出線粒體膜電位的相對(duì)數(shù)值。與空白組比較，Iso組MMP降低了37.3%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。L-carnitine和propranolol組與Iso組相比MMP增高，差異有顯著性。表明L-carnitine可以在一定程度上起到保護(hù)心肌線粒體的作用(Fig 3，4)。

Tab 2 Effects of L-carnitine on contents of hydroxyproline(Hpy)，lactic acid(LAC)and free fatty acids(FFA)in myocardial hypertrophy induced by Isoproterenol(Iso)in rats(±s，n=8)

Tab 2 Effects of L-carnitine on contents of hydroxyproline(Hpy)，lactic acid(LAC)and free fatty acids(FFA)in myocardial hypertrophy induced by Isoproterenol(Iso)in rats(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs Iso group

Group Hpy/μg·g－1Pro LAC/mmol·g－1Pro FFA/μmol·g－1Pro Control 0.41 ±0.039 0.39 ±0.036 195.87 ±24.71 Iso 0.63 ±0.028＊＊ 0.48 ±0.084＊＊ 254.26 ±25.11＊＊L-carnitine 0.53 ±0.031## 0.41 ±0.035## 211.53 ±22.65##Propranolol 0.48 ±0.021＊＊ 0.46 ±0.015＊＊ 244.16 ±40.90＊＊

3 討論

目前，MH已被公認(rèn)為是猝死、心力衰竭等心血管事件強(qiáng)有力的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，因此，探索用于防治該病的藥物對(duì)與臨床用藥有重要的指導(dǎo)意義。Iso是一種人工合成的兒茶酚胺，連續(xù)皮下注射Iso可以起MH，操作簡單易于掌握，這一模型已被廣泛使用［7］。本次試驗(yàn)在此模型基礎(chǔ)上用L-carnitine干預(yù)治療，普萘洛爾為對(duì)照，目的在于觀察L-carnitine對(duì)Iso所致大鼠MH的保護(hù)作用。結(jié)果顯示:L-carnitine有改善心功能、降低重量指數(shù)、抗心肌細(xì)胞肥大的作用。Iso組在心臟重量指數(shù)、羥脯氨酸含量指標(biāo)中都較空白組有明顯增加，說明連續(xù)注射Iso確實(shí)可引起大鼠MH并伴有纖維化，對(duì)心肌組織切片的鏡下觀察也可以充分證實(shí)這一點(diǎn)。而MH伴纖維化也正是該組大鼠心臟舒張功能下降的直接原因。L-carnitine能改善Iso所引起的心臟重量指數(shù)增加和Hpy含量的增高，外部表現(xiàn)即為心功能的恢復(fù)。

有人認(rèn)為L-carnitine心肌保護(hù)作用的可能機(jī)制是減少心肌對(duì) ATP儲(chǔ)備的消耗，拮抗脂質(zhì)過氧化［8］，從而在能量代謝、細(xì)胞保護(hù)、血管新生等多環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。臨床觀察應(yīng)用L-carnitine輔助治療患者冠心病、心絞痛、心肌梗死合并心源性休克的療效觀察，均發(fā)現(xiàn)L-carnitine組心功能明顯改善，治療組療效明顯優(yōu)于對(duì)照組［9］。L-carnitine在大鼠缺血/再灌注中具有抗心律失常的作用且該作用可被肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶I(CPTI)抑制劑依托莫司(etomoxir)拮抗。提示我們L-carnitine的作用可能與促進(jìn)線粒體對(duì)脂肪酸的氧化有關(guān)［10］。本次試驗(yàn)的結(jié)果就 L-carnitine對(duì)Iso引起MH大鼠心肌組織中的FFA和LAC增多都有很好的調(diào)節(jié)作用，使FFA和LAC減少。這些變化心肌肥厚的能量代謝機(jī)制直接相關(guān)，同時(shí)也不能排除其對(duì)線粒體保護(hù)所產(chǎn)生的作用。線粒體膜電位(MMP)是反映線粒體功能的重要生物能量學(xué)參數(shù)［11－12］，控制線粒體呼吸率、ATP和ROS`生成，其電位值大小可以直接反映線粒體功能的變化。Iso組的線粒體膜電位明顯降低，L-carnitine明顯提高線粒體膜電位，對(duì)線粒體的具有保護(hù)作用，又在心肌肥厚能量代謝的另一方面起到了調(diào)節(jié)作用。

Fig 3 Effects of L-carnitine on mitochondrial membrane potential(MMP)of hypertrophic cardiomyocytes induced by Iso in rats

綜上所述，L-carnitine可以通過對(duì)肥厚心肌細(xì)胞能量代謝的調(diào)節(jié)，起到改善Iso致大鼠心肌肥厚的作用，為臨床防治心肌肥厚提供新的思路。然而L-carnitine是如何作用達(dá)到保護(hù)線粒體的，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。

Fig 4 Quantitative results of JC-1 fluorescence as a marker for membrane potential changes(±s，n=5)

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