土槿乙酸抑制人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)G2/M期阻滯

買 霞，徐忠偉，陳小義，徐瑞成

(1.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院基礎(chǔ)部細(xì)胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室;2.天津市職業(yè)和環(huán)境危害生物標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300162)

土槿乙酸(pseudolaric acid-B，PLAB)是從我國(guó)松科植物金錢松的根皮及近根皮中分離出來(lái)的二萜類化合物，藥理作用廣泛。近來(lái)研究表明［1－3］，PLAB可以抑制胃癌MGC-803、乳腺癌MCF-7和前列腺癌PC-3等多種腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其抗腫瘤作用多與細(xì)胞G2/M期阻滯相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)［2］，PLAB作用于MCF-7細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞阻滯于G2/M期，細(xì)胞周期蛋白Cyclin B1和CDK1呈高表達(dá)狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)觀察PLAB對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞周期的影響及其與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白之間的關(guān)系，為闡明PLAB抗癌作用機(jī)制積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)，土槿乙酸由天津武警后勤學(xué)院生藥教研室提供，無(wú)水乙醇溶解成母液，濃度為 1 mmol·L－1，－20℃避光保存，使用時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至終濃度，培養(yǎng)液中無(wú)水乙醇終濃度低于0.1%。H-DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品。胎牛血清由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血研所提供。TRIzol試劑由Invitrogen公司生產(chǎn);四甲基偶氮唑鹽(MTT)、Hoechst 33342、碘化丙啶(PI)和二甲基亞砜(DMSO)為Sigma公司產(chǎn)品;PrimeScriptTMRT逆轉(zhuǎn)錄試劑為大連TaKaRa公司產(chǎn)品;一抗兔抗人Cyclin B1、CDK1和Cyclin D1多克隆抗體均購(gòu)Abcam公司，二抗購(gòu)自KPL公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自Millipore公司。

1.2 細(xì)胞增殖抑制檢測(cè)(MTT法) 調(diào)整細(xì)胞密度為4×104·L－1，接種于96孔板，每孔加細(xì)胞懸液100 μl，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后作藥物處理，實(shí)驗(yàn)組PLAB(終濃度分別為 10、5、1、0.5、0.1 μmol·L－1)，同時(shí)設(shè)對(duì)照組(不加藥)和空白組(只加培養(yǎng)基)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h，加 MTT 20 μl，4 h 后加入 DMSO 200 μl，避光振蕩10 min，全自動(dòng)酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定各孔吸光度(A值)。

1.3 Hoechst 33342熒光染色檢測(cè)細(xì)胞死亡特征5 μmol·L－1PLAB 作用細(xì)胞 12 和 24 h 后收集細(xì)胞，Hoechst 33342熒光染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，照相記錄。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期［4］0.5、1和5 μmol·L－1PLAB作用細(xì)胞12和24 h后，分別收集細(xì)胞，PBS洗2次，體積分?jǐn)?shù)為0.75冷乙醇固定，上機(jī)前棄乙醇，PBS洗1次，加入 RNase 100 mg·L－1，和5 g·L－1碘化乙啶(PI)染色劑，避光染色20 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。

1.5 RNA提取和Real time-PCR檢測(cè)Cyclin B1和CDK1 mRNA表達(dá) 5 μmol·L－1PLAB作用細(xì)胞12和24 h后，收集細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，按 PrimeScriptTMRT試劑盒操作合成 cDNA。引物序列見Tab 1，Real time-PCR反應(yīng)體系為20 μl(上游引物 1 μl，下游引物 1 μl，cDNA 2 μl，SYBR green PCR master mix 4 μl，ddH2O 12 μl)。擴(kuò)增條件95℃變性10 min:94℃變性5 s，65℃退火 15 s，72℃延伸15 s，共45個(gè)循環(huán):熒光檢測(cè)分析擴(kuò)增曲線和溶解曲線，反應(yīng)冷卻至40℃。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。根據(jù)Roche 1.5檢測(cè)系統(tǒng)提供Cp(Crossing Point)值，△Cp=CpGene－CpGAPDH，△△Cp=△Cptreated－ △Cpcontrol，通過(guò)相對(duì)定量法(2－△△Ct)，計(jì)算各基因mRNA表達(dá)。

1.6 Western blot法檢測(cè) Cyclin B1、CDK1 和 Cyclin D1蛋白表達(dá) 5 μmol·L－1PLAB作用細(xì)胞12和24 h后，收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS溶液洗細(xì)胞2次，每孔加入100 μl細(xì)胞裂解液［含 50 mmol·L－1Tris-HCl(pH 8.3)、150 mmol·L－1NaCl、0.02% 十二烷基硫酸鈉、1%NP-40、0.5%脫氧膽酸鈉、0.1%原礬酸鈉、100 μmol·L－1苯甲基磺酰氟溶液］，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，冰上裂解30 min，4℃低溫離心(15 min，12 000 r·min－1)，吸取上清。樣品采用 BCA法蛋白定量，上樣60 μg蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至聚氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入1∶1 000稀釋的兔抗人Cyclin B1、CDK1和Cyclin D1多克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后，加入1∶3 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌，經(jīng)ECL液化學(xué)發(fā)光，暗室X線片曝光，顯影定影。用BandScan 5.0軟件進(jìn)行A值分析。

Tab 1 Sequences of PCR primers

Tab 2 Inhibitory effect of PLAB in SKOV3cell proliferation of each group at different time points(A，±s，n=6)

Tab 2 Inhibitory effect of PLAB in SKOV3cell proliferation of each group at different time points(A，±s，n=6)

The PLAB groups were different significantly compared with control group，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

PLAB final concentration/μmol·L －1 Time/h 24 48 72 0 1.3202 ±0.0859 2.6002 ±0.1623 2.2777 ±0.1094 100.5675 ±0.0211＊＊ 0.7218 ±0.0403＊＊ 0.5218 ±0.0301＊＊5 0.6113 ±0.0489＊＊ 0.7697 ±0.0273＊＊ 0.6190 ±0.0111＊＊1 0.7693 ±0.0286＊＊ 1.1752 ±0.1009＊＊ 1.0252 ±0.0782＊＊0.5 1.0248 ±0.0854* 2.2157 ±0.0528* 2.2615 ±0.0835 0.1 1.241 ±0.0729* 2.3080 ±0.1173*2.311 ±0.0856

2 結(jié)果

2.1 土槿乙酸對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖抑制作用 SKOV3細(xì)胞經(jīng) PLAB(終濃度為 10、5、1、0.5、0.1 μmol·L－1)處理后，均受到不同程度的抑制，并呈時(shí)間及劑量依賴性，其中藥物作用24、48和72 h的IC50值分別為 2.44、1.60、2.94 μmol·L－1(Tab 2)。

2.2 土槿乙酸可誘發(fā)SKOV3細(xì)胞凋亡 經(jīng)熒光染色后可見對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)整，核較大，核染色質(zhì)均勻，被Hoechst 33342染成藍(lán)色均勻一致熒光(Fig 1A)。5 μmol·L－1PLAB 處理的 SKOV3細(xì)胞可見規(guī)律性的變化，即作用12、24 h后部分細(xì)胞呈現(xiàn)形態(tài)不規(guī)則，核染色質(zhì)凝集，核膜破裂等凋亡細(xì)胞形態(tài)(Fig 1B，1C)。

2.3 SKOV3細(xì)胞周期變化 PLAB(終濃度分別為0.5、1、5 μmol·L－1)作用于 SKOV3細(xì)胞 12 和 24 h后流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期結(jié)果顯示(Fig 2)，對(duì)照組G2/M期細(xì)胞比例分別為12.5%和15%;0.5、1、5 μmol·L－1PLAB 作用于 SKOV3細(xì)胞 12 h，G2/M期細(xì)胞比例分別為18.4%、40.3%、52.4%;作用24 h G2/M期細(xì)胞比例分別為29.3%、42.5%、53.9%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。由此可見，隨著PLAB濃度升高，G2/M期細(xì)胞比例明顯增大并表現(xiàn)出時(shí)間依賴性，這說(shuō)明PLAB可將SKOV3細(xì)胞阻滯于G2/M期。

2.4 SKOV3細(xì)胞Cyclin B1和CDK1 mRNA表達(dá)

通過(guò)相對(duì)定量法(2－△△Ct)計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組 SKOV3細(xì)胞的相關(guān)基因表達(dá)(Tab 3)，5 μmol·L－1PLAB 作用SKOV3細(xì)胞12和24 h兩個(gè)檢測(cè)點(diǎn)中，Cyclin B1基因水平分別是對(duì)照組的1和50.75倍;CDK1基因水平分別是對(duì)照組的84.94和209.94倍;結(jié)果顯示5 μmol·L－1PLAB 阻滯于 G2/M 時(shí) Cyclin B1、CDK1呈高表達(dá)狀態(tài)(P＜0.05)。

2.5 SKOV3細(xì)胞 Cyclin B1、CDK1 和 Cyclin D1蛋白表達(dá) Western blot結(jié)果顯示(Fig 3)，與對(duì)照組細(xì)胞相比，5 μmol·L－1PLAB 作用 SKOV3細(xì)胞 12、24 h后，細(xì)胞于G2/M阻滯的同時(shí)，可見細(xì)胞周期Cyclin B1、CDK1蛋白呈高表達(dá)狀態(tài)，Cyclin D1蛋白呈低表達(dá)狀態(tài)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，尤其以作用24 h處理組更為明顯(P＜0.01)。

Fig 1 Morphologic changes of SKOV3cells treated with 5 μmol·L －1PLAB at different time points by fluorescence microscope(× 100)

Fig 2 Flow cytometric analysis of the cell cycle distribution in SKOV3cells of PLAB treatment at different time points

3 討論

土槿乙酸的藥理學(xué)研究及體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)PLAB具有廣泛的抗腫瘤活性，選擇性抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)正常細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響［5－6］，活體無(wú)明顯毒性。實(shí)驗(yàn)采用不同濃度PLAB作用于SKOV3細(xì)胞，MTT結(jié)果顯示PLAB能抑制SKOV3細(xì)胞的生長(zhǎng)，且抑制作用呈時(shí)間－濃度依賴性。

Tab 3 The Cyclin B1 and CDK1 mRNA levels of SKOV3cells treated with 5 μmol·L －1PLAB for different time by Real time-PCR(±s)

Tab 3 The Cyclin B1 and CDK1 mRNA levels of SKOV3cells treated with 5 μmol·L －1PLAB for different time by Real time-PCR(±s)

The PLAB groups were different significantly compared with control group，*P ＜0.05

Gene Relative amount(2－△△Ct)Exposure time/h 0 12 24 Cyclin B1 0.24 ±0.07 0.48 ±0.06 12.18 ±3.21*CDK1 0.03 ±0.02 2.82 ±0.21* 6.97 ±0.74*

文獻(xiàn)報(bào)道，卵巢癌占女性惡性腫瘤的4%，是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，其5年生存率在早期患者為90%，晚期患者則不足30%［7］。研究表明在卵巢細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中，除了癌基因/抑癌基因正負(fù)調(diào)節(jié)失控外，細(xì)胞周期蛋白(Cyclins)也是參與卵巢細(xì)胞癌變過(guò)程的重要調(diào)控因子，其中Cyclin B1是與細(xì)胞G2/M檢測(cè)點(diǎn)有關(guān)的重要細(xì)胞周期調(diào)控因子。生理情況下，體內(nèi)外信號(hào)激活Cyclin B1后，Cyclin B1在S期開始合成并在G2期定位于細(xì)胞胞質(zhì)，Cyclin B1的濃度在細(xì)胞內(nèi)達(dá)到臨界域值后結(jié)合CDK1并磷酸化CDK1Thr160/Thr161，形成異源二聚體Cyclin B1/CDK1，即細(xì)胞成熟促進(jìn)因子(maturation promoting factor，MPF)，進(jìn)細(xì)胞從G2期進(jìn)入M期，啟動(dòng)細(xì)胞有絲分裂［8］。Yu 等［9］證實(shí) PLAB 可以增加核內(nèi)Cyclin B1的表達(dá)，提高Cyclin B1從胞質(zhì)向核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，并阻止核內(nèi)的Cyclin B1降解，而核內(nèi)Cyclin B1上調(diào)是M期周期阻滯的標(biāo)志。Welsh等［10］應(yīng)用寡核苷酸芯片在卵巢癌組織及SKOV3細(xì)胞系中檢測(cè)到Cyclin B1和CDK1的高表達(dá)，Cyclin B1的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致G2/M期關(guān)卡失控，使本來(lái)應(yīng)停止增殖或生理性凋亡的細(xì)胞不停地進(jìn)入細(xì)胞周期，因而造成惡性增殖，說(shuō)明Cyclin B1有可能參與卵巢腫瘤發(fā)生及惡性進(jìn)展。

Fig 3 The Cyclin B1，CDK1 and Cyclin D1 expression levels of SKOV3cells treated with 5 μmol·L －1PLAB for different time by Western blot

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí):PLAB作用于SKOV3細(xì)胞后，隨著藥物濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例明顯升高。Western blot結(jié)果顯示，5 μmol·L－1PLAB處理SKOV3細(xì)胞，隨著時(shí)間進(jìn)程，Cyclin B1和CDK1表達(dá)均上調(diào)，Cyclin D1表達(dá)下調(diào)。課題組推測(cè)PLAB引起SKOV3細(xì)胞Cyclin B1和CDK1表達(dá)升高，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)MPF分子的不斷積聚，致大量處于S期時(shí)相的細(xì)胞進(jìn)入G2/M期，同時(shí)缺乏介導(dǎo)處于G2/M期時(shí)相進(jìn)入G0/G1期的Cyclin D1，因此，發(fā)生細(xì)胞周期G2/M期阻滯現(xiàn)象。是否PLAB阻止Cyclin B1降解從而使細(xì)胞阻滯于G2/M期尚需進(jìn)一步研究。

［1］孟愛(ài)國(guó)，石 峻，劉春艷，等.土槿乙酸抑制體外人胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2008，28(5):455－9.

［1］Meng A G，Shi J，Liu C Y，et al.Pseudoaric acid B inhibits growth of human gastric carcinoma cellsin vitro［J］.Bas Clin Med，2008，28(5):455－9.

［2］于靜華，田代真一，小野寺敏，等.土槿皮乙酸不通過(guò)Fas途徑誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡和M期周期阻滯［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(11):1509－13.

［2］Yu J H，TASHIRO Shin-ichi，ONODERA Satoshi，et al.Pseudolaric acid B induced apoptosis and mitotic arrest circumventing Fas receptor pathway in MCF-7 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(11):1509－13.

［3］程文龍，李晨光，馬武男，等.土槿皮乙酸體外對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖的抑制作用及機(jī)制［J］.中藥藥理與臨床，2011，27(1):9－13.

［3］Cheng W L，Li C G，Ma W N，et al.Inhibitions of pseudolaric acid B on prostate carcinoma PC-3 cells and its mechanism［J］.Chin Tradit Med Pharmacol Clin，2011，27(1):9－13.

［4］吳寶明，李 俊，呂雄文，等.蜂毒素對(duì)SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)及G2/M期阻滯的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(2):222－5.

［4］Wu B M，Li J，Lü X W，et al.Effects of melittin on the growth and G2/M phase arrest in SGC-7901 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(2):222－5.

［5］Wong V K，Chiu P，Chung S S，et al.Pseudolaric acid B，a novel microtubule-destabilizing agent that circumvents multidrug resistance phenotype and exhibits antitumor activityin vivo［J］.Clin Cancer Res，2005，11(16):6002－11.

［6］王 輝，雷志勇，陳 虹，等.土槿乙酸衍生物PB-LY體外抗腫瘤作用及其機(jī)制研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(9):1204－8.

［6］Wang H，Lei Z Y，Chen H，et al.Antitumor activity of PB-LY and its mechanismin vitro［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(9):1204－8.

［7］Parkin D M，Bray F，F(xiàn)erlay J，Pisani P.Global cancer statistics 2002［J］.CA Cancer J Clin，2005，55(2):74－108.

［8］Stark G R，Taylor W R.Control of the G2/M transition［J］.Mol Biotechnol，2006，32(3):227－48.

［9］Yu J H，Cui Q，Jiang Y Y，et al.Pseudolaric acid B induces apoptosis，senescence，and mitotic arrest in human breast cancer MCF-7［J］.Acta Pharmacol Sin，2007，28(12):1975－83.

［10］Welsh J B，Zarrinkar P P，Sapinoso L M，et al.Analysis of gene expression profiles in normal and neoplastic ovarian tissue samples identifies candidate molecular markers of epithelial ovarian cancer［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(3):1176－81.?