人參皂苷Rg1抗血管內膜增生與其抗氧化和上調eNOS表達作用的關系

高 楊，吳 芹，楊丹莉，鄧 江，黃燮南

(貴州省基礎藥理重點實驗室暨遵義醫學院藥理學教研室，貴州遵義 563000)

經皮腔內冠狀動脈介入治療 (PCI)已成為治療冠心病的重要手段，然而，PCI術后存在的再狹窄問題卻嚴重影響了其遠期療效［1］。一般認為，血管平滑肌細胞(VSMC)增殖、肥大、遷移是血管術后再狹窄等的病理基礎［2］。已有研究表明，人參皂苷Rg1(Rg1)能抑制腫瘤壞死因子-α所致VSMC增殖［3－4］。我們先前的研究也證實，人參總皂苷及Rg1均能抑制球囊損傷所致大鼠頸動脈內膜增厚［5－6］，在培養的 VSMC，人參總皂苷對血小板源性生長因子誘導的VSMC增殖也具有抑制作用［7］。然而，VSMC增殖受多種因素的調控，其中，氧化應激［8］和一氧化氮 (NO)形成［9］均明顯影響 VSMC增殖。因此，本研究擬觀察Rg1的抗血管內膜增生作用與其抗氧化應激和促NO生成的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 ♂ SD大鼠，清潔級，體質量300～350 g，由第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心提供［許可證號:SCXK-(軍)2007-017］。

1.2 藥品及試劑 Rg1:北京奧明興業科技有限責任公司提供 (純度95%);SOD、MDA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、β-actin引物、TRIzol(TaKaRa生物工程公司);逆轉錄反應體系試劑盒(Applied Biosystems公司);SYBR?GREEN PCR Master Mix(Warrington WA14SR.UK);RNA純化試劑盒 (上海華舜生物工程有限公司)。

1.3 儀器 Fogarty導管(美國edwards lifescience公司);Leica光學顯微鏡及照相系統(德國Leica Microsystems Ltd);Mastercycler Gradient PCR儀、Centrifuge 5417R/5415D離心機 (德國Eppendorf公司);icycler熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)。

1.4 方法

1.4.1 大鼠頸總動脈球囊損傷模型的制備 大鼠用20%水合氯醛 (2 ml·kg－1)腹腔注射麻醉后仰臥位固定，用碘伏消毒頸部皮膚并作前正中切口，分離左頸總動脈和頸外動脈，用血管夾阻斷前者近心端和左頸內動脈;結扎頸外動脈遠心端并在其近心端剪一小口，將2 F球囊導管插入去除血管夾后的頸總動脈起始部，注入約0.1 ml生理鹽水使球囊略充盈，緩慢推拉球囊導管3次以剝脫頸動脈內皮，負壓回抽生理鹽水，退出導管，結扎左頸外動脈，縫合皮膚切口。假手術組除不插入球囊導管外，其余操作與模型組相同。術后每只大鼠注射12萬U芐星青霉素預防感染，清醒后置籠喂養。

1.4.2 動物分組及取材 大鼠隨機分5組:假手術組和模型組給予等體積生理鹽水;3個給藥組造模后分別給 Rg1 4、8、16 mg·kg－1。術后次日腹腔注射給藥，連續14 d。最后1次給藥的次日，將大鼠麻醉后取血用于SOD、MDA檢測，并迅速取出損傷的左頸總動脈，用預冷生理鹽水沖洗干凈，取中間段標本放入10%中性福爾馬林中固定24 h，石蠟包埋后用于形態學觀察。剩余標本用濾紙吸干后，立即置液氮中速凍，然后放－70℃冰箱中凍存用于Real-Time RT-PCR檢測。

1.4.3 SOD活性和MDA含量測定 按相應試劑測試盒說明操作。

1.4.4 病理學組織觀察 將上述石蠟包埋標本切片，行蘇木精－伊紅 (H.E.)染色，Leica光學顯微鏡下觀察血管腔形態、內膜增厚情況，并拍照記錄。用Q Win圖像處理與分析系統測定新生內膜面積和中膜面積，并計算內膜面積/中膜面積比值，每個標本觀察3張切片，取平均值。

1.4.5 Real-Time RT-PCR 檢測 VSMC 中 eNOS mRNA的表達 取冷凍血管標本置于0.5 ml TRIzol液中，用研磨杵充分勻漿至組織完全裂解，在上述含有樣品的Eppendorf(EP)管中加入0.2 ml氯仿，快速搖勻，以12 000×g·min－1在4 ℃下離心10 min，取出上清液，小心吸取上層水相置于另一無菌的新EP管中，加等量異丙醇，輕搖混勻后，室溫靜置10 min，再以12 000×g·min－14℃離心10 min，肉眼可見白色半透明的細胞總RNA沉于管底，棄去上清液。加入75%乙醇0.5 ml，以12 000×g·min－1在4℃下離心10 min，小心棄去乙醇。將EP管倒置于濾紙上，讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥，至乙醇完全揮發，加DEPC水100 μl溶解。RNA純化后進行樣品純度鑒定。兩步法逆轉錄－聚合酶鏈反應如下:首先從基因庫GeneBank中查出相關引物序列，由TaKaRa生物工程公司合成相應引物(見Tab 1)。

Tab 1 Primer pairs used in Real-Time PCR

PCR反應體系為20 μl第一步，95℃×10 min;第二步，95℃ ×15 s，退火溫度 ×1 min，循環45次。結果分析處理(相對定量法)，以Ct值為統計參數依次計算下列數據:(1)Ct average=(Ct1+Ct2+Ct3)/3(重復管);(2)dCt=Ct average－中間值;(3)基因的表達=2^(－dCt);(4)相對定量=目的基因的表達/內參基因的表達

1.4.6 統計學處理 采用SPSS16.0統計軟件，所有數據均以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(One Way ANOVA)。

Fig 1 Effects of Rg1 administration on morphological changes of ballon-injured carotid artery of rats

2 結果

2.1 Rg1對大鼠頸動脈球囊損傷模型血管形態學變化的影響

2.1.1 H.E.染色血管形態學變化及Rg1對其影響

光鏡下，與假手術組(Fig 1A)比較，可見球囊損傷的各組血管標本均有不同程度的內膜增厚，管腔狹窄，大量新生內膜形成，各處新生內膜厚薄不一，以模型組(Fig 1B)最為嚴重。Rg1(4、8、16 mg·kg－1)給藥各組較模型組新生內膜厚度明顯減小(Fig 1C，D，E)。

2.1.2 Rg1對大鼠球囊損傷后頸動脈形態學指標的影響 H.E.染色切片經圖像分析的結果表明，與假手術組比較，模型組的新生內膜面積和內膜面積/中膜面積比值均分別增加了十多倍。Rg1(4、8、16 mg·kg－1)給藥可呈劑量依賴性減輕球囊損傷所致新生內膜增厚(P＜0.01)，見Tab 2。

Tab 2 Effects of Rg1 administration on neointimal area and the ratio of neointimal area/media area in balloon-injured carotid artery of rats(±s，n=6)

Tab 2 Effects of Rg1 administration on neointimal area and the ratio of neointimal area/media area in balloon-injured carotid artery of rats(±s，n=6)

##P ＜0.01 vs sham;＊＊P ＜0.01 vs model

Group Neointimal area/μm2 Neointimal area/media area Sham 6774.67 ±1094.84 0.13 ±0.01 Model 105020.7 ±27616.15## 1.71 ±0.28##Rg1 4 mg·kg－1 50539.68 ±27920.20＊＊ 0.81 ±0.45＊＊Rg1 8 mg·kg－1 41533.91 ±23274.37＊＊ 0.67 ±0.29＊＊Rg1 16 mg·kg－1 28434.56 ±17236.42＊＊ 0.45 ±0.27＊＊

2.2 大鼠血漿中SOD活力的變化 Tab 3的結果表明，模型組較假手術組SOD活力降低了22%(P＜0.01)，Rg1(4、8、16 mg·kg－1)各給藥組與模型組比較，該指標分別升高了21%、23%、24%(P＜0.05)，3個劑量組間呈一定的劑量依賴性趨勢。

Tab 3 Effects of Rg1 administration on SOD activities in plasm of rats with balloon-injured carotid artery(±s)

Tab 3 Effects of Rg1 administration on SOD activities in plasm of rats with balloon-injured carotid artery(±s)

##P＜0.01 vs sham;*P＜0.05 vs model

Group n SOD/kU·L －1 Sham 8 104.30 ±11.37 Model 6 81.71 ±8.60##Rg1 4 mg·kg－1 8 98.68 ±4.99*Rg1 8 mg·kg－1 8 100.71 ±2.97*Rg1 16 mg·kg－1 7 101.62 ±7.20*

2.3 大鼠血漿中MDA含量的測定 模型組大鼠血漿中 MDA 的含量為 14.42 μmol·L－1，較假手術組約升高了168%(P＜0.01);另一方面，Rg1(4、8、16 mg·kg－1)各給藥組的MDA含量均較模型組明顯降低(P＜0.01)，且3個劑量組間呈一定的劑量依賴關系(Tab 4)。

Tab 4 Effects of Rg1 administration on MDA level in

blood plasm of rats with balloon-injured carotid artery(±s)

##P ＜0.01 vs sham;＊＊P ＜0.01 vs model

2.4 Rg1對球囊損傷后血管壁eNOS mRNA表達的影響 Real-Time RT-PCR檢測結果顯示，球囊擴張損傷頸動脈可明顯下調eNOS mRNA表達。與假手術組比較，模型組的eNOS mRNA表達僅為前者的4%(P＜0.01)。Rg1 4 mg·kg－1對 eNOS mRNA表達下調雖無統計學上明顯的改善作用(P＞0.05)，但仍有上調的趨勢，當其劑量為8、16 mg·kg－1時，便能明顯上調由球囊損傷所降低的eNOS mRNA表達，使之分別恢復到假手術組的54%和56%(P＜0.01)。

Fig 2 Effects of Rg1 administration on the expression of eNOS mRNA in balloon-injured carotid artery of rats(±s，n=6)

3 討論

本實驗的結果顯示，Rg1 4，8，16 mg·kg－1給藥兩周，可明顯改善球囊損傷所致以血管新生內膜增厚為主的形態學變化，提示其對血管內膜異常增生有抑制作用。

研究表明，氧化應激通過活化巨噬細胞釋放細胞因子和生長因子，刺激基質重塑和平滑肌細胞增殖;活性氧還可調節基質金屬蛋白酶參與基質重塑，導致新的細胞外基質和平滑肌細胞的積聚以致新生內膜的形成，從而引起球囊損傷后管腔狹窄［8］。因此，氧化應激被認為與AS及經皮腔內冠狀動脈形成術(PCI)后再狹窄的發病有密切關系，抑制氧化應激便有可能抑制血管損傷后的再狹窄［10－11］。已有研究發現［12］，每天給小劑量抗氧化劑普羅布考(probucol)可減輕PCI所致血管再狹窄的發生率和嚴重性。業已明了，SOD活力的高低可反映機體內抗自由基水平的高低。而測定MDA含量可間接反映自由基對機體的損傷程度。我們的實驗表明，Rg1呈劑量依賴性地降低頸動脈球囊損傷后大鼠血漿中MDA的含量，而提高SOD的活力。表明Rg1能減輕氧化應激，發揮抗脂質過氧化作用，該作用可能是其抗球囊損傷所致血管內膜增生的機制之一。

目前，NO抑制VSMC增殖的作用已得到充分肯定。有研究表明［9］，NO生成藥如硝普鈉等能呈劑量依賴性地抑制VSMC增殖，給予NO前體藥左旋精氨酸、口服NO供體藥嗎多明(molsidomine)和長時間直接吸入NO均能明顯減輕球囊損傷所致血管內膜增厚。還有文獻報道，損傷的VSMC在轉染了eNOS基因后能充分分化，降低細胞的增殖率［13］，從而肯定了eNOS在抑制細胞增殖中的作用。

本室既往研究發現，在培養的新生乳鼠心肌細胞，Rg1可促進NO釋放，參與其抗心肌細胞肥大效應［14］;利用縮窄腹主動脈所致左室心肌肥厚模型的研究也發現，NO生成在Rg1的抗心肌肥厚中發揮一定作用［15］。在本研究中，我們雖未能測定血管壁NO濃度的變化，但發現模型組eNOS mRNA表達量僅為假手術組的4%，而Rg1給藥后，特別是8 mg·kg－1和 16 mg·kg－1組，大鼠頸動脈 eNOS mRNA 表達量可恢復到假手術組的一半以上。該結果似能表明，Rg1可通過改善和恢復大鼠球囊損傷后血管壁eNOS的表達，促進NO的產生，減輕內膜增殖，成為其抗囊損傷后血管再狹窄的另一個機制。

綜上所述，Rg1抑制球囊損傷后血管內膜異常增生的作用，可能與其抗氧化應激和上調NOS mRNA，促進NO生成有關。

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