高效液相色譜法測定茶葉中五種水溶性維生素

郭玉華，郁有祝

（安陽工學院化學與環境工程系，河南 安陽 455000）

高效液相色譜法測定茶葉中五種水溶性維生素

郭玉華，郁有祝

（安陽工學院化學與環境工程系，河南 安陽 455000）

用高效液相色譜（HPLC）梯度洗脫法測定茶葉中的5種水溶性維生素成分和含量，結果表明，樣品經XDB-C18柱分離，使用紫外檢測器（波長266 nm），流動相為甲醇與0.03 mol/L KH2PO4（pH＝6.1）混合，梯度洗脫，樣品中5種水溶性維生素得到良好分離，該5種水溶性維生素標準曲線相關系數均達0.9990以上，平均回收率為84.5%～102.7%，變異系數RSD<5.4%。測得普洱茶中VC的含量為14.37 mg/100g，VB1的含量為2.17 mg/100 g，VB6的含量為1.58 mg/100 g，VB2的含量為3.47 mg/100 g，葉酸含量為1.34 mg/100 g；信陽毛尖中VC的含量為11.69 mg/100 g，VB6的含量為1.76 mg/100 g，VB2的含量為8.12 mg/100 g，葉酸含量為9.66 mg/100 g，未檢出VB1。

高效液相色譜；水溶性維生素；茶葉

茶葉作為傳統飲料，含有豐富的蛋白質、氨基酸、生物堿、茶多酚、糖類、有機酸、芳香物質、水溶性礦物質和多種水溶性維生素。茶葉備受人們的喜歡且長盛不衰，除了客觀原因以外主要取決于它的自身價值和一定的藥理作用。茶對人們的養生、保健、以及疾病防疫等都有一定的功效。

水溶性維生素常用的測定方法[1]有：紫外分光光度法、熒光法和高效液相色譜法，此外還有毛細管電泳法[2]。紫外分光光度法干擾比較嚴重，一般需要經過適當的前處理，且很難找到一種顯色劑能夠同時測定，因此不適于多組分同時測定。熒光法測定維生素的靈敏度高，但線性范圍窄，適合含量較低的維生素測定。高效液相色譜法因處理樣品簡單、快速，且能同時測定幾種維生素而被廣泛應用于食品[3-5]、藥品[6]中維生素的測定。本論文對色譜條件進行了優化，并進行了方法學評價，在優化的色譜條件下對普洱茶和信陽毛尖中的5種水溶性維生素含量進行了測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent l200型高效液相色譜儀：美國Agilent科技有限公司，配紫外檢測器；維生素標準品：上海融禾醫藥科技發展有限公司，純度＞98%；甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純。

1.2 維生素標準儲備液的配制

用電子天平準確稱取一定量的VC﹑VB1﹑VB6﹑VB2、煙酸，用新配制的0.1 mol/L的鹽酸溶解后定容配成一定濃度的標準儲備液。葉酸則以少量稀KOH溶解后，再用0.1 mol/L的鹽酸定容配成一定濃度的標準儲備液。使用前，根據需要以0.1 mol/L的鹽酸稀釋成指定濃度的標準工作液。

1.3 樣品處理

用烘箱將茶葉低溫烘干（溫度不要超過60℃），然后用研缽研碎，用電子天平準確稱取一定量的毛尖和普洱茶，用0.1 mol/L的鹽酸浸泡，用超聲清洗器振蕩30 min，再在70℃的恒溫箱中水浴30 min后，取上層清液，加入飽和的醋酸鉛溶液，混勻后靜置，取上層清液過濾，備用。

1.4 色譜條件

色譜柱：XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；

采用梯度洗脫：流動相A為0.03 mol/L KH2PO4（pH＝6.1），B 為甲醇，從進樣時 90%的 A 經 10 min線性變化為50%的A；流速為1.0 mL/min；檢測波長為266 nm。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 流動相及梯度洗脫條件

本研究采用甲醇/緩沖溶液體系梯度洗脫[4]，測試了流動相A和B在梯度起始和結束時不同組成比例下的洗脫狀況，試驗結果表明：當采用流動相體系A為 0.03 mol/L 磷酸二氫鉀（pH＝6.1），B 為甲醇，從進樣時90%的A經10 min線性變化為50%的A時，6種維生素分離情況較好，在12 min內出峰完全（見圖1c）。

2.1.2 流動相中緩沖液pH對分離效果的影響

水溶性維生素在水中易產生電離，電離后的離子在反相柱中的保留時間較短，不利于分離。試驗中通過調節流動相中KH2PO4溶液的pH來控制水溶性維生素的電離，從而提高6種維生素在色譜柱上的保留能力，達到有效分離。試驗結果見圖1。

圖1 流動相中緩沖液pH對6種水溶性維生素分離的影響Fig.1 Effect of the pH of the buffer in the mobile phase on separation of the six water-soluble vitamins

由圖1可見，流動相中 KH2PO4的pH對VC、煙酸、VB1之間的分離影響很大，對其余3種維生素的分離影響不大，并且KH2PO4的pH對VB1的保留時間影響很大。當pH等于3.5時，VB1與VC峰部分重疊，VB1保留時間小于VC的保留時間，6種維生素的保留時間順序為VB1

2.1.3 檢測波長的確定

將6種維生素標準液分別掃描200 nm～350 nm的吸收光譜，試驗結果表明：VC、VB1、VB6、VB2、煙酸、葉酸的最大吸收波長分別為 266、260、292、266、261、279nm，由于VB1、VB6的保留時間相差小，難以進行波長切換，又在VB6前后的幾種水溶性維生素的最大吸收波長均在266 nm附近，故選擇檢測波長為266 nm。

2.2 方法學評價

2.2.1 線性范圍及檢出限

以標準維生素的一系列濃度，按上述色譜條件每種濃度進樣5 μL。分別以各成分的峰面積y對標準工作溶液的質量濃度X（mg/L）進行線性回歸分析，回歸分析結果、檢出限（信噪比S/N>3）列于表1，結果表明在表1所列的線性范圍內，線性關系良好。

2.2.2 精密度與準確度

分別取5份云南普洱茶樣品，按上述方法進行樣品處理和色譜分離測定，由它們的結果計算方法精密度。本方法測定結果的相對標準偏差為2.9%～5.4%。采用加標回收率評價方法的準確度，結果表明，6種維生素的回收率測定范圍在84.5%～102.7%。

表1 6種水溶性維生素的線性回歸方程、相關系數、線性范圍和檢出限Table 1 Regression equation,correlation coefficients,linear ranges and detection limits of six water-soluble vitamins

2.3 樣品測定

將樣品按上述方法處理后，按最佳色譜條件對茶葉樣品中的維生素含量進行了測定，測定結果見表2。普洱茶和信陽毛尖的色譜圖見圖2。

表2 普洱茶和毛尖茶中水溶性維生素含量Table 2 Content of water-soluble vitamins in Pu Er tea and Mao Jian tea mg/100 g

圖2 茶葉樣品色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of the tea samples

3 結論

采用酸水解法處理樣品、流動相梯度洗脫，可簡單、快速地測定茶葉中的5種水溶性VC、VB1、VB2、VB6和葉酸。結果表明：使用該方法檢測，平均回收率為84.5%～102.7%，變異系數RSD<5.4%，準確度和精密度均能滿足定量分析的要求，對食品、水果蔬菜中水溶性維生素的測定有一定的參考價值。

[1]Maria Cortes S M,Montana C H,Carmen D M.Comparison of highperformance liquid chromatography and spectrofluorimetry for vitamin C analysis of green beans[J].Eur Food Res Technol,2000,210:220-225

[2]鄧光輝,李濟權,馬少妹.高效毛細血管電泳電導法快速檢測復方維生素片中的、VB12、VB6和VC[J].分析實驗室,2003,22(4):53-55

[3]成志強,孫成均,黎源倩.反相高效液相色譜法同時測定食品和多維片中8種水溶性維生素[J].分析化學,2001,29(9):1068-1071

[4]黃紅霞.HPLC法測定蘑菇粉等中水溶性維生素的含量[J].海峽藥學,1999,11(4):33-35

[5]賀利民,呂岱竹,蘇貽娟.高效液相色譜法同時測定多種水溶性維生素[J].海南大學學報:自然科學版,2004,22(1):54-56

[6]申燁華,張萍,孔祥虹,等.高效液相色譜法同時測定扁桃仁中的水溶性維生素C,B1,B2,B6[J].色譜,2005,23(5):538-541

Determination of Five Water-Soluble Vitamins in Tea by High Performance Liquid Chromatography

GUO Yu-hua,YU You-zhu
(Department of Chemistry and Environmental Engineering,Anyang Institute of Technology,Anyang 455000,Henan,China)

A HPLC gradient elution method with UV detector was established to determine five Water-Soluble Vitamins in the tea.The optimized conditions as follows:XDB-C18column with methanol and 0.03 mol/L KH2PO4buffer (pH=6.1)as mobile phase,and gradient elution,detector wavelength was 266 nm.The correlation coefficients were more than 0.9990.The recoveries were 84.5%-102.7%,RSD<5.4%.For vitamins C,B1,B2,B6and Folic Acid,the contents were found to be 14.37 mg/100 g,2.17 mg/100 g,3.47 mg/100 g,1.58 mg/100 g and 1.34 mg/100 g in Puer tea;for Maojian tea,the contents of vitamins C,B2,B6and Folic Acid were 11.69 mg/100 g,8.12 mg/100 g,1.76m g/100 g,9.66 mg/100 g,respectively.While vitamin B1was not discovered in Maojian tea.

high performance liquid chromatography;water-soluble vitamins;tea

郭玉華（1979—），女（漢），講師，碩士，主要從事藥物分析化學研究。

2011-12-10