猴STLV病毒gag蛋白在昆蟲細胞中的表達

王 瓊 張利仙 李維薇 李 冰 艾 軍 周曉黎

（1.中國科學院昆明動物研究所，昆明 650223；2.大理洱海湖泊研究中心，大理 671000；3.云南出入境檢驗檢疫局，昆明 650228）

非人靈長類動物由于其與人類相似的生物和行為特征，成為解決人類健康和疾病問題的理想動物模型[]。隨著國際市場對實驗猴需求量的增加，對實驗猴也提出了嚴格的要求，實驗猴從普通級別向SPF（無特定病原體）猴發展[]。1992年，中華人民共和國衛生部頒布的《醫學實驗動物標準》規定，STLV-1型是SPF實驗猴必須排除的病毒之一。自從1982年首次在非人靈長類動物發現存在自然發生的HTLV相關病毒之后，從世界各地的非人類靈長類動物中發現許多猿猴T細胞淋巴細胞白血病病毒（STLV）的不同譜系（STLV-l、STLV-2、STLV-3）[1-2]。猴嗜T淋巴白血病病毒（Simian T-lymphotropic virus，STLV），它與人T淋巴白血病病毒（Human T-lymphotropic virus，HTLV）統稱為靈長類嗜T淋巴細胞病毒（Primate T-lymphotropic virus，PTLV），屬于RNA腫瘤病毒亞科，δ逆轉錄病毒屬[3]。STLV 與惡性淋巴瘤、淋巴組織增生等疾病具有相關性，但大多數情況下，感染了STLV的獼猴僅僅作為病毒攜帶者而在相當長一段時期內表現為無癥狀狀態。大量的文獻報道，STLV不僅可以在非人靈長類間傳播，還可以傳播給人類。

中國是世界上靈長類資源豐富的國家之一，隨著國際市場對靈長類資源的需求量的增大，同時對出口的靈長類動物提出嚴格的檢疫要求。STLV病毒的存在不僅影響實驗猴的質量，而且對飼養人員和實驗人員的健康也存在很大的隱患。目前，對STLV病毒的檢測方法主要有病原分離、PCR、熒光免疫及ELISA方法。在進出口貿易的檢疫中，一般采用的是血清學檢測法，一種方法是采用細胞系對分離到的病毒進行培養，然后收集其分泌液作為抗原來檢測猴群中血清STLV抗體的含量，這種方法不但成本較高而且對工作人員的安全有較高的威脅；另一種方法是使用商品化的試劑盒來檢測STLV病毒，現在市場上使用較多的是用HTLV的相應抗原作為診斷抗原，這種方法特異性不夠高[4]。因此建立一種方便、快捷、靈敏度高、特異性強、經濟節約的檢測方法是必要的。

本實驗通過人工合成STLV病毒保守基因gag，構建昆蟲桿狀病毒表達載體，并轉染sf9細胞，成功表達出猴STLV病毒gag蛋白，為以基因工程抗原為基礎的猴STLV病毒ELISA檢測方法的建立奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 質粒和菌種

Pbluescriptsk-gag（攜帶人工合成的猴嗜T淋巴白血病病毒STLV gag 基因）其gag基因參照序列genbank（登錄號：AY590142），由上海生工合成。pFastBacHTB質粒、ECoil.Top10和DH10Bac菌株，為云南出入境檢驗檢疫局動檢實驗室保存。

1.2 主要的試劑和儀器

質粒小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購于AxyGEN公司，限制性內切酶BamHI和HindIII、DNA Marker、T4連接酶購于TaKaRa公司；Cellfectin轉染試劑盒購自invitrogen公司；胎牛血清、Grace，s 細胞培養基購自GBICO公司；抗HIS單抗購自天根生化科技有限公司，山羊抗小鼠IgG/辣根酶（HRP標記）購自Southern Biotech公司；PCR儀是eppondoff。其他試劑及儀器均為商業公司購買。

1.3 引物設計與合成

根據S T L V g a g基因堿基序列設計了兩對引物，其中，S015-CGGCGAGAATACCAGCAACT-3，S02：5-TTCCAGTGGGTTGGGTCTTG-3，跨幅452bp，用于gag的鑒定；S1：5-TTTGGATCCATGAAATTCTTAGTCAACGTT -3，S2 5-CCCAAGCTTTTAAGCCTCCCCCCCT -3，下劃線部分分別為BimHI和HindIII酶切位點，跨幅1395bp用于擴增STLV gag基因；通用引物（M13）序列參照Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統使用手冊，以上引物均由invitrogen公司合成。

1.4 pFastBacHTB-gag重組質粒的構建

用引物S1和S2，以Pbluescriptsk-gag質粒為模板，通過PCR擴增得到gag基因片段。通過BamHI和HindIII酶雙酶切，與用相同的酶切處理的昆蟲表達載體pFastBacHTB連接。連接產物轉化TOP10感受態細胞，經過慶大霉素和氨芐青霉素培養基篩選，提取質粒，通過對重組質粒進行PCR擴增、酶切和測序鑒定，表明獲得了重組質粒pFastBacHTB-gag。

1.5 重組質粒 pFastBacHTB-gag的轉座

將陽性質粒 pFastBacHTB-gag轉化含有桿狀病毒穿梭載體的DH10Bac感受態細胞，構建桿狀病毒表達載體，通過卡那霉素、四環素和慶大霉素篩選重組轉座子Bacmid-gag，提取桿粒，分別用M13引物和引物S01/S02進行PCR鑒定。

1.6 重組桿粒在昆蟲細胞中的表達及重組蛋白的鑒定

提取轉座桿粒Bacmid-gag，按Cellfection轉染試劑說明書轉染sf9昆蟲細胞，在28℃培養96h后，反復凍融細胞，收集上清液并盲傳3代，將反復凍融細胞后得到的上清液進行SDS-PAGE及Western blot鑒定。

2 結果

2.1 重組質粒pFastBacHTB-gag的鑒定

重組質粒pFastBacHTB-gag 經 BamHI和HindIII酶切處理后，回收gag基因片段，與經過相同酶切處理的pFastBacHTB載體相連，轉化TOP10感受態細胞，得到重組質粒pFastBacHTB-gag。該質粒用引物S01/S02對其進行擴增，擴增產物為452bp（見圖1泳道2），與理論值相符。同時經BamHI和HindIII雙酶切，酶切產物分別為1395bp和4766bp（見圖1泳道1），均與理論值相符。

圖1 pFastBacHTB-gag雙酶切及PCR鑒定

2.2 轉座桿粒的PCR鑒定

pFastBacHTB-gag轉化DH10Bac感受態細胞，經慶大霉素、卡那霉素、四環素篩選后，提取其重組桿粒Bacmid-gag，分別用M13引物和S01/S02引物對其進行PCR鑒定，擴增產物分別為3825bp（見圖2泳道1和2）和452 bp（見圖2泳道3），表明獲得了轉座的桿粒。

圖2 重組桿粒Bacmid-gag的PCR鑒定結果

2.3 重組蛋白gag的鑒定

重組桿粒Bacmid-gag轉染sf9 昆蟲細胞96 h后，取其上清液感染昆蟲細胞，并盲傳3代后，將反復凍融細胞后得到的上清液進行SDS-PAGE及Western blot鑒定，結果如圖3（條帶1和2）、4所示，結果表明成功的獲得重組gag蛋白。

圖3 gag 重組蛋白的SDS-PAGE 鑒定

圖4 gag 重組蛋白的western blot鑒定

3 討論

本研究提出一種能在昆蟲細胞中成功表達STLV病毒gag基因的方法，這一方法的優勢在于三點：一是人工合成STLV病毒保守基因gag，避免直接接觸活病毒的培養；二是表達載體pfastbacHTB上的6xHis 標記，組氨酸標簽的優點在于它在非變性（能保持蛋白質的構象和功能）和變性（包涵體形式的蛋白質）條件下都能有效地工作，因此表達載體上的6xHis 標記為表達出的蛋白的純化提供了方便。三是昆蟲細胞表達系統具有原核細胞無法比擬的優點：表達量高且對蛋白的后加工系統與哺乳動物細胞接近，能識別與切除信號肽，能對表達的蛋白進行切割、磷酸化、糖基化等修飾，表達的外源蛋白接近天然蛋白，具有很高的生物學活性。

國內學者盧愛桃等人用原核表達系統成功表達出了STLV病毒gag重組蛋白，以表達抗原建立其ELISA檢測方法，結果表明所建立的方法檢測自然感染的籠養恒河猴血清中STLV-1抗體取得了良好的效果。

本實驗正是基于盧愛桃等人的研究結果，結合昆蟲細胞表達系統的優良特點，通過構建昆蟲細胞表達載體，成功地在昆蟲細胞中表達出猴STLV病毒gag蛋白，為建立基因工程抗原為基礎的猴STLV病毒ELISA檢測方法奠定基礎。

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