化學計量學方法用于甘草和芫花及其藥對的揮發(fā)性成分分析Δ

周 能，周 振，梁逸曾，曾楚杰

（1.玉林師范學院化學與材料學院，廣西玉林537000；2.中南大學化學化工學院，長沙 410083）

化學計量學方法用于甘草和芫花及其藥對的揮發(fā)性成分分析Δ

周 能1，2＊，周 振1，梁逸曾2#，曾楚杰1

（1.玉林師范學院化學與材料學院，廣西玉林537000；2.中南大學化學化工學院，長沙 410083）

目的：分析甘草和芫花單味藥材及其藥對的揮發(fā)性成分。方法：以正十四烷為內標，采用氣相色譜-質譜聯用技術對甘草、芫花的單味藥材及其組成的藥對的揮發(fā)性成分進行測定，利用多種化學計量學方法對產生的二維色譜/質譜數據同時進行分辨和解析，獲取各個組分的純色譜曲線和純質譜，根據分辨得到的純質譜在質譜庫中進行相似檢索以實現對組分的定性。利用轉換移動窗口因子分析法對組合前后的成分進行歸屬分析，采用面積歸一化法進行定量。結果：分別在甘草、芫花及其藥對中鑒定出34、41和68個成分，占各自揮發(fā)油成分的90%、84%和75%。藥對中揮發(fā)性成分的相對含量與單味藥比較差異較大。結論：本試驗結果可為中藥配伍的研究提供較為重要的依據。

甘草；芫花；揮發(fā)油化學成分；藥對；氣相色譜-質譜聯用技術；轉換移動窗口因子分析法

甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch，GUF）是中醫(yī)應用最為廣泛的原料藥[1]。在中藥處方中，芫花（Daphne genkwa Sieb，DGS）是毒性藥，其劑量被嚴格限制。在中國和朝鮮，DGS被用于治療水腫、哮喘和癌癥[2]。根據中藥的基本藥性理論[3]，GUF與DGS不能共用于一個方中，但對其共用的物質基礎沒有進一步說明。有關GUF和DGS單味藥化學成分的研究已有不少報道，但是GUF-DGS藥對的物質基礎缺乏系統的研究。本研究利用氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用技術并結合化學計量學方法如直觀推導式演進投影法（HELP）和轉換移動窗口因子分析法（AMWFA）[4～6]對該藥對的單味藥與藥對在煎煮過程中的物質及其變化作較為系統的探討，GUF、DGS和其藥對中的揮發(fā)性成分被分別提取，然后被GC-MS聯用技術測定，所獲得的二維數據利用化學計量學方法進行分辨，使得單味藥和藥對中的揮發(fā)性成分被鑒定和定量。結果顯示，單味藥和藥對中揮發(fā)性成分的相對含量有了很大的變化。本試驗對中藥配伍的研究具有較為重要的意義。

1 儀器與試藥

2010型GC-MS儀、MS工作站、NIST107型 MS庫（日本島津公司）。

正己烷（分析純，蘇州市第二化工研究所）；正十四烷（色譜純，美國Sigma公司）。GUF和DGS均購于廣西玉林中藥材專業(yè)市場，經湖南師范大學醫(yī)學院趙冰清教授鑒定均為真品。

2 方法

2.1 揮發(fā)油的提取

GUF和DGS于60℃干燥3 h。稱取GUF（30 g）、DGS（30 g）、GUF-DGS（30 g-30 g）樣品，分別置于500 mL圓底燒瓶中，加水浸泡3 h后照揮發(fā)油測定法[7]提取揮發(fā)油，收集揮發(fā)油，轉移至2 mL量瓶中，加入一定量的正十四烷（約0.2μL）作為內標，以正己烷稀釋到刻度，4℃貯藏，備用，分析時取1μL進樣。各種樣品均重復做2份。

2.2 GC-MS測定條件

2.2.1 GC條件 色譜柱：OV-1毛細管柱（30 m×0.25 mm I.D.，0.25μm）；進樣口溫度：280℃；載氣：氦氣；流速：0.70 mL·min－1；分流比：1∶1；程序升溫（起始溫度為60℃，保持4 min；以2℃·min－1的速度升至66℃，保持3 min；以2℃·min－1的速度升至70℃，保持3 min；以3℃·min－1的速度升至100℃，保持1 min；以4℃·min－1的速度升至130℃，保持2 min；以5℃·min－1的速度升至190℃，保持1 min；以3℃·min－1的速度升至220℃，保持1 min；以5℃·min－1的速度升至250℃）；進樣量：1.0μL。

2.2.2 MS條件 離子源：標準EI源（轟擊能量：70 eV）；離子源溫度：280℃；接口溫度：280℃；質量掃描范圍：20～450 amu；掃描間隔：0.2 s/次；溶劑切除：4 min。

2.3 數據處理

所有數據分析均在Celeron（R）2.53 GHz（Intel）個人計算機上完成。采用峰面積歸一化法確定各化合物的相對含量。文中所涉及程序采用MATLAB 6.5編寫；數據文件由自編的程序轉為文本文件后，在MATLAB 6.5中處理。解析后的光譜在NIST147和107標準MS庫中進行檢索，結合文獻[8，9]數據進行定性。

2.4 采用AMWFA分辨數據

一般而言，GC-MS聯用技術由于受到測量背景和峰重疊的影響，使測定的MS與標準MS庫的匹配搜索非常困難；此外，峰的漂移使得在不同體系中（如在單味藥和藥對中）進行成分的鑒定和比較相當棘手。因此，在許多情況下，大量的數據被浪費了。幸運的是，化學計量學方法如HELP[10]、光譜相關色譜法（SCC）[11，12]等，已經成功地用于處理這些數據并解決像中藥這樣復雜的體系。AMWFA[4]對存在于不同復雜體系中的化學成分的比較研究非常有幫助，故本研究應用此方法并結合HELP進行分析。

3 結果與討論

3.1 用AMWFA對單味藥和藥對進行定性和比較分析

GUF、DGS和其藥對中揮發(fā)性成分的總離子流圖分別見圖1～圖3。

從圖1～圖3可以看出，中藥中的揮發(fā)性成分是非常復雜的。除了幾個較大的峰以外，還存在其他大量小峰。在這些峰之中，有超過100個相對含量＞0.1%的峰。當對這些峰進行分析時，背景會受到嚴重影響，而大峰的延伸也會干擾小峰的鑒定分析。此外，盡管對分離條件進行了優(yōu)化，還有部分峰重疊在一起。因此，如果沒有對GC-MS數據進行進一步處理就進行定性和定量分析是很困難的，也是不準確的。在這部分工作中，應用AMWFA可對數據進行扣背景、消除大峰干擾和對重疊峰進行分辨。此外，還可用AMWFA對藥對和組成它的單味藥進行比較。

在此，筆者選擇58.5 min附近的峰簇（見圖4）為例來說明如何利用AMWFA進行重疊峰的分辨、比較和鑒定來自2個復雜體系的共有組分并獲取其純MS。圖4顯示，GUF-DGS和DGS的色譜圖非常相似，而GUF的色譜信號相對于GUF-DGS和DGS較弱，其形狀也有些不同。乍一看在這一時間段內僅存在2種成分，但結果證明這是不正確的。子空間比較法和奇異值法都顯示在該時間段內GUF-DGS和DGS都含有3種成分。多組分光譜相關色譜（MSCC）和逆向組分光譜相關色譜（IP-MSCC）顯示，GUF-DGS中的組分包含DGS中的組分，反之亦然。接著進行的是共有秩分析，結果發(fā)現在GUF-DGS和DGS中有3種共有組分，這與前述結果一致。

利用AMWFA進行進一步解析可以得到各組分的解析色譜圖，見圖5；抽取的純MS圖見圖6。

圖6的上方是共有秩圖（common rank map），該圖顯示了所研究的峰簇在不同的時間點有多少共有組分；圖6的中間是光譜自相關曲線（spectral auto-correlative curves），它表示相鄰兩點MS的相似度，在該曲線的單組分區(qū)可進行純MS的提取；圖6的下方是所提取的某組分的純MS。用所提取的純MS在NIST147和107標準MS庫中進行檢索，并結合一些文獻，該成分被鑒定為十八碳烯酸甲酯。另外2個在GUF-DGS和DGS中的共有組分分別被鑒定為亞油酸甲酯和5，11，14，17-二十碳四烯酸甲酯。

同法對GUF-DGS和GUF中的共有組分進行分析，結果顯示它們之間只有1個共有組分，即亞油酸甲酯。其他峰簇可同樣使用AMWFA進行比較和分析。所有AMWFA解析結果與經典的HELP分析結果一致。而以本中心開發(fā)的中藥相似度評價軟件對重復的2個樣品進行相似度分析，發(fā)現它們的相似度在0.95以上，說明試驗結果是可靠的。

3.2 藥對成分定量分析

單個成分的含量以面積歸一化法進行測定，而對于重疊峰的含量以解析后的峰面積進行計算。通過分析，GUF-DGS、DGS和GUF中分別有68、41和34個成分得到定量，占各自揮發(fā)性成分的75%、84%和90%。因為在每一種揮發(fā)油溶液中都加入了等體積的正十四烷（內標），因此用單個成分的面積百分數與正十四烷（內標）的面積百分數之比來說明藥對組合前后的含量變化更加合理。30 g GUF、DGS以及它們各30 g組成的藥對的2次重復試驗的平均結果見表1（表1中，RC為相對百分含量，RC＝某成分百分含量/內標百分含量；RT為保留時間（min））。

3.3 GUF-DGS藥對和單味藥中揮發(fā)性成分的比較分析

從表1可以看出，大多數存在于單味藥（GUF、DGS）中的揮發(fā)性成分均可以在它們組成的藥對（GUF-DGS）中找到，只有極少數成分未能在藥對中檢測到（相對含量為0.02～2.02）。另外，還有一種成分（2-辛烯醛，相對含量為0.43）只能在藥對中檢測到，而在單味藥中未能找到。這說明藥對的揮發(fā)性成分幾乎完全來源于各單味藥，這2味中藥單獨煎煮和組合煎煮對揮發(fā)性成分的種類沒有影響。

續(xù)表1Contiuned tab 1

但是，藥對中揮發(fā)性成分的相對含量與單味藥相比發(fā)生了較大的變化，只有5種成分是藥對含量大約等于單味藥含量之和。此外，GUF-DGS中2-庚酮（保留時間為7.350 min）的相對含量為0.65，大于該成分在GUF中的相對含量（0.13）與在DGS中的相對含量（0.09）之和。類似還有44個成分在藥對中的含量大于單味藥含量之和。GUF-DGS中亞油酸（保留時間為59.640 min）的相對含量為0.89，小于該成分在GUF中的相對含量（11.4）與在DGS中的相對含量（3.56）之和。類似還有18個成分的含量變化屬于這種情況。這種含量變化最高可達10倍。而有趣的是，藥對中成分含量減少的，其保留時間大多在50 min以后（沸點相對較高）；而藥對中成分含量增加的，其保留時間大多在50 min以前（沸點相對較低）。單味藥和藥對中的主要成分如棕櫚酸、亞油酸甲酯、葉綠醇、亞油酸和硬脂酸的絕對減少量較大。這些變化也存在于其他藥對和它們的單味藥之中[13]，研究者將這種變化的原因歸于在煎煮過程中的酸堿反應：存在于單味藥的生物堿和有機酸可以在煎煮過程中發(fā)生反應生成有機鹽，而這種有機鹽可以溶解于水中而失去揮發(fā)性[13]。此外，在高溫和長時間的煎煮過程中，其他類型的反應也可能發(fā)生。事實上，這種變化的原因和意義還有待進一步研究。

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Analysis of Volatile Components in Glycyrrhiza uralensis and Daphne genkwa and Their Drug-pair by Chemometric Methods

ZHOU Neng，ZHOU Zhen，ZENG Chu-jie
（College of Chemistry&Materials，Yulin Normal University，Guangxi Yulin 537000，China）
ZHOU Neng，LIANG Yi-zeng
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Central South University，Changsha 410083，China）

OBJECTIVE：To analyze the volatile components in Glycyrrhiza uralensis and Daphne genkwa and their drug-pair.METHODS：With tetradecane as internal standard，the volatile components in G.uralensis and D.genkwa and their drug-pair were determined by GC/MS technique.Multiple chemometric methods were used to identify and analyze two dimension chromatograms/mass spectrum in order to obtain pure GC curves and pure MS of each component.The quality of components was identified through pure MS similarity retrieval.The attributions of components were analyzed by transform and subwindow factor analysis before and after compatibility，and quantitative study was conducted by peak area normalization method.RESULTS：34，41，68 components were qualitatively identified in G.uralensis and D.genkwa and their drug-pair，representing about 90%，84%，75%of volatile oil of them，respectively.Relative contents of volatile components in drug-pair were greatly different from those of single ingredient.CONCLUSION：Results of study can provide important basis for the research of TCM compatibility.

Glycyrrhiza uralensis；Daphne genkwa；Chemical components of volatile oil；Drug-pair；GC/MS；Transform and subwindow factor analysis

R284.1；R284.2

A

1001-0408（2012）43-4078-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.43.18

Δ國家自然科學基金資助項目（81060360）；廣西自然科學基金面上項目（2010GXNSFA013065）；2010年“廣西高校優(yōu)秀人才資助計劃”項目

＊教授，博士。研究方向：中藥現代化。電話：0775-2818619。E-mail：2818619@163.com

#通訊作者：教授，博士研究生導師。研究方向：化學計量學和中藥現代化。電話：0731-88830831。E-mail：yizeng_Liang@263.net

2011-11-05

2012-01-09）