炎調(diào)方對膿毒癥大鼠血清炎癥因子的調(diào)控作用

施 榮 熊旭東 李淑芳 王 倩

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021）

膿毒癥是具有感染依據(jù)的全身炎癥反應(yīng)綜合征 （SIRS），是燒創(chuàng)傷、休克、感染等臨床危急重癥患者的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，也是誘發(fā)膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征（MODS）的重要原因。炎癥因子的超量釋放是膿毒癥的主要病理生理特征，有效調(diào)控炎癥介質(zhì)的釋放對治療膿毒癥具有重要意義。筆者通過臨床觀察，認(rèn)為膿毒癥為腑實營熱證，通腑清營法切中膿毒癥之根本病機(jī)。本研究旨在探討炎調(diào)方治療膿毒癥的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物 炎調(diào)方由桃仁、生大黃、芒硝、玄參、赤芍、當(dāng)歸等組成，均符合2005版《中國藥典》規(guī)定并加工炮制合格的飲片，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院中藥房提供。煎煮方法：加10倍體積蒸餾水將飲片浸泡30 min，先煮桃仁、玄參、赤芍、當(dāng)歸，沸騰后繼續(xù)煎煮20 min，起鍋前10 min加入大黃，第二煎加6倍體積的蒸餾水煎煮，沸騰后繼續(xù)煎煮20 min。2次煎液混合，用4層無菌紗布過濾，芒硝最后納入藥液中充分溶解，藥液最后濃縮成含生藥1.0 g/mL，置40℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗動物 雄性SD大鼠60只，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組和炎調(diào)方組。

1.3 分組及造模 盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）制備膿毒癥模型［1］：大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，以腹正中作一1.5 cm長的切口，找到盲腸，在其根部結(jié)扎，用18號針穿通3次，輕擠出少量腸內(nèi)容物，留置2 mm皮瓣防止針孔閉合，還納盲腸于腹腔，逐層縫合腹壁切口，術(shù)畢皮下注射生理鹽水（30 mL/kg）抗休克。大鼠隨機(jī)分為4組：正常組（6只），麻醉后腹主動脈采血致死；假手術(shù)組（6只），麻醉后開腹翻動腸道，關(guān)腹，12 h后麻醉并腹主動脈采血致死；模型組（24 只），分別于CLP 后 2、8、12、24 h麻醉并腹主動脈采血致死，每個時間點(diǎn)6只；炎調(diào)方組（24只）：造模前炎調(diào)方灌胃（9.9 g/kg）3 d，每日 1次，第 3次灌胃后 2 h行CLP術(shù)造模，分別于CLP后2、8、12、24 h麻醉并腹主動脈采血致死，每個時間點(diǎn)6只。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 （1）血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-10檢測。經(jīng)腹主動脈取血，靜置30 min后，離心取血清，-70℃保存待測。嚴(yán)格按試劑盒要求操作，雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清 TNF-α、IL-6、IL-10質(zhì)量濃度，ELISA試劑盒為R&D公司原裝產(chǎn)品，由上海森雄科技實業(yè)有限公司提供。（2）肺組織染色。無菌留取正常組、假手術(shù)組及模型組和炎調(diào)方組各時間點(diǎn)大鼠完整左肺組織，10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察比較肺組織損傷情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組血清細(xì)胞因子測定結(jié)果 見表1。模型組各時間點(diǎn)TNF-α、IL-6、IL-10 水平均高于假手術(shù)組（P＜0.05 或 0.01）；模型組及炎調(diào)方組TNF-α在2 h開始升高，8 h到高峰，炎調(diào)方組與模型組相比，明顯下降（P＜0.05或0.01）；模型組及炎調(diào)方組IL-6隨時間延長逐漸升高，12 h到達(dá)高峰，炎調(diào)方組與模型組相比，除24 h外，其他時間點(diǎn)均顯著下降（P＜0.01）；IL-10隨時間延長逐漸下降，炎調(diào)方組與模型組相比，明顯升高（P＜0.05或0.01）。

表1 各組大鼠血清 TNF-α、IL-6、IL-10 水平比較（pg/mL，，n=6）

表1 各組大鼠血清 TNF-α、IL-6、IL-10 水平比較（pg/mL，，n=6）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組同時間點(diǎn)比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組 別 TNF-α IL-6 IL-10正常組 16.31±1.47 22.36±1.04 30.00±2.80假手術(shù)組 17.68±3.27 23.36±3.69 35.67±2.26模型組 2h 47.92±3.15** 52.04±4.06** 78.42±2.26**8h 67.59±4.65** 71.15±4.10** 78.86±9.73**12h 48.69±3.58** 85.89±4.38** 63.59±4.83**24h 26.43±3.50* 65.46±6.24** 54.12±2.15*炎調(diào)方組 2h 29.69±4.35△ 33.10±3.69△△ 118.12±8.73△△8h 35.36±3.31△△ 53.98±5.65△△ 90.30±3.35△12h 34.73±3.37△ 71.88±3.79△△ 81.11±3.13△△24h 18.10±2.48△ 54.50±7.40 69.22±8.29△△

2.2 各組肺組織病理切片結(jié)果 正常組及假手術(shù)組大鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見明顯病理學(xué)損傷性變化。CLP術(shù)后2 h，模型組2只大鼠肺組織出現(xiàn)局灶性肺泡壁充血，輕度肺間質(zhì)水腫，其余4只及炎調(diào)方組均未見明顯組織病理學(xué)損傷性變化；CLP術(shù)后8 h，模型組肺組織病變較2 h加重，6只大鼠均可見肺泡壁充血、增厚及肺間質(zhì)水腫范圍擴(kuò)大，并出現(xiàn)毛細(xì)血管瘀血，少量炎性細(xì)胞浸潤，輕度肺實變，與模型組相比，炎調(diào)方組6只大鼠肺組織僅見局灶性輕度肺泡壁充血，未見明顯肺間質(zhì)水腫、炎性細(xì)胞浸潤和毛細(xì)血管瘀血，無肺實變；CLP術(shù)后12 h，與8 h相比，模型組大鼠肺組織病損范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，出現(xiàn)廣泛肺泡出血，肺泡腔內(nèi)可見較多的炎性細(xì)胞浸潤，肺組織明顯實變，炎調(diào)方組僅見少量肺泡出血和炎性細(xì)胞浸潤，輕度肺實變；CLP術(shù)后24 h，模型組大鼠肺組織病變與12 h相比病變更嚴(yán)重，病變范圍更廣，出現(xiàn)廣泛的大量肺泡出血，肺泡腔內(nèi)可見大量的炎性細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管瘀血與微血栓形成明顯，肺組織實變較12 h嚴(yán)重，炎調(diào)方組與模型組相比，病變范圍較小，可見肺泡壁充血，大量肺泡出血和炎性細(xì)胞浸潤，肺實變較輕。

圖1 各組不同時間點(diǎn)肺組織病理切片圖（HE，×40）

3 討 論

感染導(dǎo)致的SIRS常發(fā)展為膿毒性休克，但決定炎癥發(fā)展結(jié)局的不止感染本身，宿主對感染的反應(yīng)也起到了至關(guān)重要的作用［2］。內(nèi)毒素、外毒素、病毒及寄生蟲感染等在機(jī)體的膿毒性反應(yīng)中均可起觸發(fā)劑的作用。TNF-α是最主要的炎性細(xì)胞因子，也是炎癥反應(yīng)的最初啟動者；IL-6被認(rèn)為與SIRS的嚴(yán)重程度和致死率有著密切的關(guān)系，是SIRS的一個標(biāo)志而非單純的一種介質(zhì)［3］。動物實驗證明，膿毒癥大鼠血清TNF-α、IL-6水平異常升高［4-5］。L-10對免疫應(yīng)答主要起抑制作用，能抑制巨噬細(xì)胞抗原呈遞，抑制巨噬細(xì)胞活化及繼發(fā)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。

膿毒癥早期多表現(xiàn)為身灼熱，煩渴，腹脹便秘，甚或斑疹隱隱、神昏譫語，舌絳少津，苔黃，脈數(shù)等癥熱毒內(nèi)盛證［6］。究其病因病機(jī)乃外感六淫，邪毒化火，或內(nèi)有郁熱，蓄而成毒，邪毒內(nèi)陷于腑，并容于營血而致本病。上述諸證，癥狀雖異，然則病機(jī)相同，皆由熱毒積聚，毒陷入腑，容于營血所致?；谝陨侠碚?，通腑清營法切中膿毒癥之根本病機(jī)，并自擬炎調(diào)方長期應(yīng)用于臨床治療膿毒癥，取得良好效果［7］。本實驗以CLP制備膿毒癥模型，炎調(diào)方灌胃治療膿毒癥，結(jié)果顯示，炎調(diào)方組與模型組相比，TNF-α水平均明顯下降；除24 h外IL-6均顯著下降；IL-10明顯升高。肺組織病理切片顯示，隨著時間延長，模型組肺組織病損程度逐漸加重，由局灶性肺泡壁充血，肺間質(zhì)水腫逐步發(fā)展為廣泛的大量肺泡出血，肺泡腔內(nèi)大量的炎性細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管瘀血與微血栓等病理改變，而炎調(diào)方組各時間點(diǎn)肺組織病理變化均較模型組輕，表明炎調(diào)方能緩解肺損傷，保護(hù)肺組織。

炎調(diào)方由生大黃、芒硝、桃仁、赤芍、玄參、當(dāng)歸等組成，方中大黃、芒硝、桃仁具有釜底抽薪、通腑存陰之功，共為君藥；赤芍、玄參清營瀉火、涼血滋陰，為臣藥；當(dāng)歸活血通便為佐藥。方中大黃、桃仁、赤芍并有活血之用，大黃并能抑制THF-α的產(chǎn)生，清除氧自由基［8］，當(dāng)歸能抑制高遷移率族蛋白B-1的聚集，防止致命性內(nèi)毒素血癥的產(chǎn)生［9］。全方配伍共奏通腑清營之功，并通腑不忘活血，配伍精妙，也很好反證了膿毒癥早期為腑實營熱證，通腑清營是治療該病早期的根本大法。

［1］Chaudry IH，Wichterman KA，Baue AE.Effect of sepsis on tissue adenine nucleotide levels［J］.Surgery，1979，85（2）：205-211.

［2］CohenJ.The immunopathogenesis of sepsis［J］.Nature，2002，420（6917）：885-891.

［3］Patel RT，Deen KI，Youngs D，et al.Interleukin 6 is a prognostic indicator of outcome in severe intra abdominal sepsis［J］.Br J Surg，1994，81（9）：1036-1038.

［4］施榮，熊旭東，李淑芳.烏司他丁調(diào)控膿毒癥大鼠TNF-α與IL-6及 IL-10 水平的研究［J］.抗感染藥學(xué)，2009，6（1）：16-19.

［5］劉韌，劉萍，田昆侖，等.地塞米松對家兔內(nèi)毒素休克的防治作用及其與 TNF 的關(guān)系［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2001，23（2）：201-203.

［6］中華醫(yī)學(xué)會急診醫(yī)學(xué)分會危重病專家委員會、中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會急救醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會.膿毒癥的定義、診斷標(biāo)準(zhǔn)、中醫(yī)證候診斷要點(diǎn)及說明（草案）［J］.中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2007，16（8）：797-798.

［7］施榮，熊旭東.通腑清營法治療膿毒癥熱毒內(nèi)盛證臨床觀察［J］.中國中醫(yī)急癥，2011，20（4）：521-522.

［8］陳德昌，李紅江，喬林，等.大黃對創(chuàng)傷后膿毒癥大鼠肝細(xì)胞線粒體功能的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2002，9（l）：9-11.

［9］Haichao W，Wei L，Jianhua L，et al.The aqueous extract of a popular herbal nutrient supplement，angelicasinensis，protects miceagainst lethal endotoxemiaand sepsis［J］.J Nutr，2006，136：360-365.