不同動(dòng)物源性鏈球菌的耐藥性分析

趙 晴，孔令聰，馬紅霞，2，高云航，林雁春

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，長春 130118;2.動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春 130118)

鏈球菌是臨床上常見的病原菌之一，其中豬源鏈球菌是一種重要的人畜共患病的病原［1］，牛源鏈球菌感染極大地增加了奶牛乳房炎的治療成本，被稱為奶牛業(yè)的“致命殺手”。隨著抗菌藥物在治療中的不合理應(yīng)用，特別是某些抗菌藥物被作為飼料藥物添加劑使用，導(dǎo)致多重耐藥性鏈球菌菌株不斷出現(xiàn)，且耐藥率高、耐藥譜廣，不僅給我國養(yǎng)殖業(yè)造成了非常嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且加劇了抗菌藥物在動(dòng)物體內(nèi)的殘留，嚴(yán)重危害了動(dòng)物食品安全［2］。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 質(zhì)控株 鏈球菌CVCC3307，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 菌株 于2010年10月至2011年8月從吉林地區(qū)分離獲得28株動(dòng)物源性鏈球菌。

1.1.3 藥品及試劑 青霉素、紅霉素、新諾明、氟苯尼考、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、克林霉素7種抗菌藥物均由北京海洋醫(yī)化生物科技有限公司惠贈(zèng)。Tryptone(Typical analysis)、Yeast Extract(Typical analysis)為Oxoid公司產(chǎn)品;特級(jí)犢牛血清為杭州四季青生物工程有限公司產(chǎn)品;瓊脂粉為北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品;氯化鈉、氫氧化鈉等均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.4 主要儀器 HS－840u型水平層流單人凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，SHA－B國華企業(yè)恒溫振蕩器(國華科學(xué)儀器有限公司)，AUY220型電子天平(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 血瓊脂培養(yǎng)基按參考文獻(xiàn)［3］進(jìn)行配制。

1.2.2 病原菌的分離鑒定 分別將疑似豬源鏈球菌感染的病豬病變器官(心、肝、脾、肺)、膿汁鼻液及患有奶牛乳房炎病牛的乳液接種于血清瓊脂板中進(jìn)行增菌培養(yǎng)18～24 h。取培養(yǎng)后的疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，如鏡檢發(fā)現(xiàn)有革蘭氏陽性菌并呈鏈球狀排列時(shí)，進(jìn)行進(jìn)一步純培養(yǎng)并觀察其菌落形態(tài)，最后通過生化試驗(yàn)鑒定其為鏈球菌屬。

1.2.3 菌落計(jì)數(shù) 采用常規(guī)方法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)［4］。

1.2.4 抗菌藥物的制備 青霉素、環(huán)丙沙星、克林霉素、多西環(huán)素用蒸餾水溶解稀釋，其中青霉素現(xiàn)用現(xiàn)配，稀釋至12.80256 IU;紅霉素先用少量乙醇溶解，再用pH 7.8緩沖液稀釋;氟苯尼考先用甲醇溶解，再用蒸餾水稀釋。以上藥物稀釋至7680 μg/mL。新諾明先用0.1%NaOH溶液溶解，再用蒸餾水稀釋至 122880 μg/mL。

1.2.5 瓊脂二倍稀釋法測(cè)定28株鏈球菌的MIC將已制備好的抗菌藥物用生理鹽水進(jìn)行倍比稀釋，制備含藥瓊脂。將純培養(yǎng)菌制成懸液，根據(jù)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，將菌液稀釋成適當(dāng)濃度(1×104～5×105CFU/mL)范圍內(nèi)，分別接種于含藥瓊脂板上37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察細(xì)菌生長情況，確定7種抗菌藥物對(duì)28株鏈球菌的MIC，進(jìn)行3次重復(fù)，按美國臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)的標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 鏈球菌的分離鑒定 通過鏡檢、生化試驗(yàn)鑒定共分離鑒定得到18株豬源鏈球菌及10株牛源鏈球菌，分別采自長春、吉林、四平、松源、九臺(tái)、德惠等地區(qū)豬場(chǎng)及雙陽、九臺(tái)、吉林、四平、公主嶺、梅河等地區(qū)奶牛場(chǎng)。

2.2 7種抗菌藥物對(duì)28株不同動(dòng)物源性鏈球菌的MIC(表1) 瓊脂二倍稀釋法測(cè)定28株鏈球菌的MIC結(jié)果顯示，從吉林省地區(qū)分離的28株動(dòng)物源性鏈球菌表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，耐藥水平較高。對(duì)紅霉素的MIC為敏感株的100倍以上的受檢菌株占總菌株數(shù)的57.14%，對(duì)克林霉素的MIC為敏感株的100倍以上的受檢菌株占總菌株數(shù)的53.57%，對(duì)青霉素的MIC為敏感株的100倍以上的受檢菌株占總菌株數(shù)的35.71%，對(duì)多西環(huán)素的MIC為敏感株的10倍以上的受檢菌株占總菌株數(shù)的75%，對(duì)新諾明的MIC為敏感株的10倍以上的受檢菌株占總菌株數(shù)的67.85%，對(duì)環(huán)丙沙星的MIC為敏感株的10倍以上的受檢菌株占總菌株數(shù)的53.57%，對(duì)氟苯尼考的MIC為敏感株的10倍以上的受檢菌株占總菌株數(shù)的14.28%。

表1 7種抗菌藥物對(duì)28株動(dòng)物源性鏈球菌的MIC μg/mL

2.3 動(dòng)物源性鏈球菌對(duì)7種抗菌藥物的耐藥譜(圖1)28株受檢菌株絕大多數(shù)為多重耐藥株。對(duì)2種抗菌藥物耐藥的菌株占7.14%，對(duì)3種抗菌藥物耐藥的菌株占10.31%，對(duì)4種抗菌藥物耐藥的菌株占21.43%，對(duì)5種抗菌藥物耐藥的菌株占21.43%，對(duì)6種抗菌藥物耐藥的菌株占14.28%，對(duì)7種抗菌藥物耐藥的菌株占21.43%。

圖1 動(dòng)物源性鏈球菌對(duì)7種抗菌藥物的耐藥譜

2.4 動(dòng)物源性鏈球菌對(duì)7種抗菌藥物的耐藥率(圖2)28株動(dòng)物源性鏈球菌對(duì)青霉素的耐藥率最高(92.86%)，其次為多西環(huán)素和環(huán)丙沙星(82.14%)、新諾明(75%)、紅霉素(67.86%)、克林霉素(57.14%)，耐藥率最低的為氟本尼考(35.17%)。

圖2 動(dòng)物源性鏈球菌對(duì)7種抗菌藥物的耐藥率

3 討論

采用瓊脂二倍稀釋法檢測(cè)動(dòng)物源性鏈球菌對(duì)7種抗菌藥物敏感性的結(jié)果表明，28株不同動(dòng)物源性鏈球菌中，僅一株為臨床分離藥物敏感株，其他菌株均對(duì)2種以上抗菌藥物耐藥，對(duì)5種以上抗菌藥物耐藥的菌株占21.43%，絕大多數(shù)呈多重耐藥性。受檢菌株對(duì)氟苯尼考的耐藥性相對(duì)較低，這可能與氟苯尼考投入獸醫(yī)臨床的時(shí)間相對(duì)較短，使用頻率相對(duì)較低有關(guān)。這種耐藥情況與國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道結(jié)果基本一致。Marie等［5］分別檢測(cè)了從法國臨床病豬及不同國家病人體內(nèi)分離的豬鏈球菌，對(duì)于臨床常用的13種抗菌藥物進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，耐藥性最為嚴(yán)重的是多西環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。Dong等［6］檢測(cè)了從韓國屠宰豬體內(nèi)分離得到的豬鏈球菌對(duì)于臨床常用的7種抗菌藥物的敏感性，結(jié)果表明，對(duì)四環(huán)素、慶大霉素和大觀霉素均耐藥。楊曉莉等［7］在寧夏地區(qū)分離得到奶牛乳房炎鏈球菌，并做了耐藥性檢測(cè)，結(jié)果顯示，沒有對(duì)17種藥物都敏感的菌株和單藥耐藥菌株，對(duì)6種以上抗菌藥物耐藥的菌株占90%。

研究結(jié)果表明，受檢豬源鏈球菌對(duì)紅霉素耐藥水平高(MIC＞512 μg/mL)，但對(duì)青霉素耐藥水平較低，可能是某些養(yǎng)殖場(chǎng)為了預(yù)防豬肺疫等疾病，將大環(huán)內(nèi)酯類藥物作為飼料藥物添加劑進(jìn)行飼喂，導(dǎo)致豬源鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥水平升高。受檢牛源鏈球菌對(duì)青霉素耐藥水平高(MIC＞512 μg/mL)，但對(duì)紅霉素敏感，其結(jié)果可能與第四代頭孢菌素類抗感染藥物的廣泛使用有關(guān)，導(dǎo)致β－內(nèi)酰胺類藥物耐藥水平增高。動(dòng)物源性病原菌的耐藥譜及耐藥水平可能發(fā)生時(shí)間性地變遷，即長期使用某種抗菌藥物造成高度耐藥后，停止使用該類藥物一段時(shí)間后，細(xì)菌可能恢復(fù)對(duì)該類藥物的敏感性。建議臨床用藥時(shí)可以更替選擇病原菌敏感藥物進(jìn)行相應(yīng)疾病治療。

吉林省不同動(dòng)物源性鏈球菌耐藥性檢測(cè)結(jié)果提示，目前吉林省部分地區(qū)豬鏈球菌病可選用青霉素治療，鏈球菌所致的奶牛乳房炎可選用紅霉素或克林霉素治療，也可選用受試菌均較敏感的氟苯尼考進(jìn)行該疾病的治療。因上述受試菌的采集地有限，建議在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，應(yīng)通過藥敏試驗(yàn)篩選有效的抗菌藥物進(jìn)行鏈球菌病的治療以杜絕濫用藥物，從而減少耐藥性的直接和間接傳播。設(shè)法研制鏈球菌多重耐藥抑制劑，延長抗菌藥物的使用時(shí)間已迫在眉睫［8－9］。

［1］ 劉荻萩，李艷華，蔡雪輝，等.鏈球菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性的作用機(jī)制［J］.國外醫(yī)藥(抗生素分冊(cè))，2007，28(3):103 －107.

［2］ Dziva F，Muhairwa A P，Bisgaard M.Diagnostic and typing options for investigating diseases associated with Pasteurella multocida［J］.Veterinary Microbiology，2008，128(1/2):1 －22.

［3］ 徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，1994:1340.

［4］ 徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:1649－1650.

［5］ Marie J，Morvan H，Berthelot－ Heraultf，et al.Antimicrobial susceptibility of Streptococcus suis isolated from swine in France and from humans in different countries between 1996 and 2000［J］.J Antimicrob Chemother，2002，50(2):201 －209.

［6］ Han D U，Choi C，Ham H J，et al.Prevalence，capsular type and antimicrobialsusceptibility ofStreptococcussuisisolated from slaughter pigs in Korea［J］.Can J Vet Res，2001，65(3):151 －155.

［7］ 楊曉莉，王桂琴，侯鵬霞，等.奶牛乳房炎鏈球菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010，(10):56 －57.

［8］ 馬紅霞，鄧旭明，李乾學(xué)，等.吉林省動(dòng)物病原性大腸桿菌的耐藥性監(jiān)測(cè)試驗(yàn)［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，23(4):85－88.

［9］ 馬紅霞，賈紹娟，劉玉堂，等.不同動(dòng)物源性大腸桿菌的耐藥性檢測(cè)［J］.中國獸醫(yī)雜志，2008，44(6):81 －83.