轉甲狀腺素蛋白的化學修飾物在肺感染性疾病診斷中的作用*

王 瑄 段紅茹 曹旭東 曲 紅 穆 云 孫續國

肺感染性疾病可形成胸腔積液。目前臨床上常檢測胸腔積液葡萄糖及蛋白含量等指標以鑒別滲出液和漏出液[1-2]，或者用較為靈敏的自動化儀器檢測胸腔積液中特異微生物的種類和型別[3-4]。該類患者肺部組織細胞轉甲狀腺素（TTR）蛋白及mRNA均陰性，血清含量為150～300 mg/L。最近有研究認為TTR表達與腫瘤表達有關系[5]。本研究旨在探討胸腔積液和血清中TTR蛋白的含量及其化學修飾類型在診斷肺感染性疾病中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010年12月—2011年5月于天津市胸科醫院就診的肺感染性疾病合并胸腔積液患者（患者組）22例，男16例，女6例，年齡18～78歲，平均（52.0±18.4）歲。另選取經過檢查健康志愿者16例為對照組，男10例，女6例，年齡42～65歲，平均（55.2±11.2）歲。肺感染的診斷參考2008年修訂內科診療標準。2組性別（χ2=0.448）和年齡（t=0.721）差異無統計學意義（均P>0.05）。

1.2 方法 患者采空腹血，分離血清2 mL用于生化項目測定。同時采集胸腔積液留取10 mL用于其生化項目的測定和細胞形態學、細胞計數測定。利用TBA120全自動生化分析儀(日本東芝公司)，測定血清和胸腔積液中各生化指標，總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）的含量應用化學反應方法測定；葡萄糖（GLU）、三酰甘油（TG）、膽固醇（Cho）含量和乳酸脫氫酶（LDH）與腺苷脫氨酶（ADA）的活性用酶動力學法測定，試劑購自上海執誠生物技術有限公司和北京科美生物技術有限公司。利用TOSHIBA-40分析儀（上海執誠生物試劑有限公司）測定血清和胸腔積液的TTR、載脂蛋白（Apo）A、ApoB含量，嚴格按照操作要求進行。基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）法分析TTR蛋白的化學修飾，150 μL血清或胸腔積液標本中加入15μL抗-人血清TTR抗體，37℃作用1 h，9 000×g離心5 min，沉降物分別用生理鹽水和雙蒸水各洗滌2次，最后使TTR蛋白與相應抗體分離，質譜分析TTR蛋白的化學修飾。

1.3 統計學分析 采用SPSS11.5軟件進行統計學處理，正態分布計量資料用±s表示，否則用M（P25，P75）表示，組間比較進行t檢驗或秩和檢驗；計數資料組間比較行χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者組胸腔積液與血清的生化成分含量比較 除LDH差異無統計學意義外（P>0.05），其他各指標差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01），見表1。

Table 1 Comparison of biochemical ingredients between pleural effusion and serum in patients表1 患者組胸腔積液與血清的生化成分含量比較[n=22，±s或M（P25，P75）]

Table 1 Comparison of biochemical ingredients between pleural effusion and serum in patients表1 患者組胸腔積液與血清的生化成分含量比較[n=22，±s或M（P25，P75）]

*P<0.05，**P<0.01

部位胸腔積液血清t TG（mmol/L）0.26±0.13 1.02±0.33 9.978**Cho（mmol/L）1.47±0.72 3.67±0.86 9.203**TTR（mg/L）68.60±35.5 148.101±52.21 5.860**ApoA（g/L）0.47±0.28 0.94±0.18 6.654**ApoB（g/L）0.53±0.14 0.96±0.14 10.154**部位胸腔積液血清t或Z TP（g/L）35.36±11.53 62.31±7.10 9.065**ALB（g/L）21.44±7.95 36.46±4.72 7.578**ADA（U/L）15.66±8.89 7.90±2.35 3.781**GLU（mmol/L）3.67（2.63，7.00）5.29（4.61，5.83）2.408*LDH（U/L）212.60±131.76 190.73±63.60 0.674

2.2 患者組選定蛋白血清含量及其半衰期 血清中ALB和球蛋白含量分別為TTR蛋白的約243倍和172倍，血清中TTR蛋白分子大小與白蛋白相近，而TTR半衰期約2 d，見表2。

2.3 肺感染患者血清與胸腔積液TTR蛋白的化學修飾結果比較 對照組血清TTR蛋白存在有3種類型修飾峰，b：磺化（sul）-TTR；c：半胱氨酰化（cys）-TTR；d：半胱氨酰甘氨酰化（cysgly）-TTR。患者組血清和胸腔積液只有b和c的修飾峰，均未檢測到d型修飾峰，見圖1、見表3。

Table 2 The half-life of serum proteins表2 血清蛋白含量及半衰期

Figure1 Chemical modification of TTRproteinsby MALDI-TOF-MSanalysis圖1 MALDI-TOF-MS法分析TTR蛋白的化學修飾

Table 3 The proportion of chemically modified type in the total TTR proteinsin serum and pleural effusion表3 血清和胸腔積液中發生化學修飾TTR占總TTR的比例 （%）

3 討論

通過檢測血清實驗指標用于輔助診斷肺感染已經廣泛用于臨床實驗診斷。分析肺感染并發胸腔積液中來源于血漿的生化指標，可能更直接反應肺感染。大量研究已經證實血清內TTR蛋白幾乎全部來源于肝臟細胞合成分泌[6]。胸腔積液內TTR蛋白來源于肝臟實質細胞，經過血液和淋巴液途徑轉運而來。本研究結果顯示，胸腔積液內TTR含量明顯低于血清，提示其有可能作為一項輔助診斷指標。肺感染患者胸腔積液中白細胞數量增加，可導致胸腔積液中ADA活性升高，但是肺腫瘤等ADA也可增高，作為輔助診斷指標存在非特異性。胸腔積液GLU含量在是漏出液時與血糖接近，在胸腔積液內存在細菌感染時，由于細菌消耗可導致GLU含量降低。同時測定血清和胸腔積液GLU含量有助于診斷，但是血清中含量容易受激素等其他因素影響，因此作為診斷生物標志物存在局限性。

目前，臨床已經成功制備TTR抗體，酶聯免疫法測定TTR技術成熟，測定結果穩定和特異。本研究顯示，患者組血清和胸腔中TTR和ALB差異有統計學意義，但TTR比ALB變化幅度較大，且TTR蛋白半衰期短于白蛋白，因此，筆者認為通過含量的變化輔助肺感染診斷TTR優于白蛋白。TTR作為肝臟分泌的蛋白與機體營養可能密切相關，肺感染患者TTR水平降低難以排除營養因素干擾，因此筆者認為增加TTR化學修飾指標可能有助于診斷。

先前筆者建立MALDI-TOF-MS分析TTR蛋白的蛋白修飾，方法可靠適用[7]。本研究表明肺感染患者組檢測到2種TTR修飾峰，其血清及胸腔積液中均未見cysgly-TTR的修飾類型，并且肺感染患者血清和胸腔積液中cysgly-TTR比例明顯低于對照組血清，提示胸腔積液內TTR蛋白含量與cys?gly-TTR的比例，有可能作為肺部感染診斷的參考指標。因此，測定肺感染患者血清和胸腔積液TTR蛋白含量減少，同時cysgly-TTR修飾類型明顯降低，有可能作為診斷肺感染的參考指標。

[1]李璧如，王瑩，錢娟，等.重癥監護病房患兒胸腔積液臨床分析[J].中國小兒急救醫學，2006，13（06）：528-530.

[2]黃生峰，孫圣華，劉宗道，等.485例胸腔積液臨床分析[J].中國當代醫藥，2011，18（12）：166.

[3]徐金平，莫麗娟.核酸擴增檢測結核桿菌DNA與抗酸桿菌涂片鏡檢結果的比較[J].檢驗醫學與臨床，2011，8（3）：348-349.

[4]劉秀云，江載芳.小兒重癥社區獲得性肺炎31例病原分析[J].中國實用兒科雜志，2005，20（12）：749-750.

[5]Liu L,Liu J,Dai S,etal.Reduced transthyretin expression in sera of lungcancer[J].Cancer sci,2007,98(10):1617-1624.

[6]Richardson SJ.Evolutionary changes to transthyretin:evolution of transthyretin biosynthesis[J].FEBSJ，2009,276(19):5342-5356.

[7]孫續國，劉金平，宋劍蟬，等.利用MALDI-TOF-MS法測定轉甲狀腺素蛋白的基因突變和化學修飾[J].中華臨床防治醫學雜志，2010，5（2）:4-7.