蜂糧源乳酸菌發酵油菜蜂花粉的工藝優化

楊文超 劉 賽 吳珍紅 繆曉青

（福建農林大學蜂學學院, 蜂產品加工與應用教育部工程研究中心，福州 350002）

蜂糧也稱蜂巢花粉、蜂面包，是雄蜂和工蜂的主要食料和營養來源，蜂糧是一個復雜的微生物系統，具有寶貴的微生物資源[1，2]。優良菌株是發酵制品得到良好的風味、質地以及產品穩定性的基礎，是保證產品標準化的關鍵[3]。乳酸菌不僅可以改善食品風味，提高食品保藏性和附加值，還有很多特殊的醫療保健功能[4-7]。從蜂糧中篩選出具有優良發酵性能的乳酸菌菌株應用在蜂花粉的發酵中，對油菜蜂花粉的深加工開發具有指導意義。

1 材料和方法

1.1 材料和設備

MRS液體培養基（1000ml）：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，K2HPO4·7H2O 2.0g，醋酸鈉·3H2O 5.0g，檸檬酸三銨 2.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O 0.05g，吐溫801.0ml，pH6.2，115 ℃滅菌15～20 min；MRS培養基：MRS液體培養基中加入1.5%瓊脂粉；麥芽汁瓊脂培養基：5°Bé麥芽汁100ml，瓊脂1.5g，pH=7.0；紅曲霉種子培養基（100ml）：5g玉米粉加適量水，于60℃水浴4 h后用8 層紗布過濾，去除殘渣得到玉米漿，加入0.2gNaNO3，0.5g KH2PO4，0.1g MgSO4·7H2O，補足蒸餾水；pH自然，121℃滅菌30min；紅曲霉發酵培養基：玉米粉10%，NaNO30.5%，KH2PO40.15%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH自然；配置方法詳見紅曲霉種子液。

蜂糧源乳酸菌的選定：經過分離、純化、初篩、復篩，從蜂糧樣品中得到3株乳酸菌。根據API 50 CH鑒定系統鑒定結果，3株菌分別為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌干酪亞種（Lactobacillus casei ssp casei）、德式乳桿菌德氏亞種（Lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii）。分別接種到油菜蜂花粉中進行單菌發酵，測定菌體生長情況和產酸情況，確定植物乳桿菌最適宜應用于蜂花粉發酵。

油菜蜂花粉：由福建省神蜂科技開發有限公司提供；煙色紅曲霉：購于中國工業微生物菌種保藏中心；胃蛋白酶：天津市諾奧科技發展有限公司。

電熱恒溫生化培養箱 SPX-250B-Z（上海博迅實業有限公司），電熱恒溫水浴鍋 DK-98-1（天津泰斯特儀器制造有限公司），人工凈化操作臺 SWCJ -1D（蘇州凈化設備有限公司），立式壓力蒸汽滅菌器 YXQ-LS-75SП（上海博迅實業有限公司醫療設備廠），恒溫搖床 HZ250L（武漢瑞華儀器設備有限責任公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種培養

乳酸菌：從MRS斜面上挑取2～3環菌株，接入裝有10ml MRS液體培養基的試管中，36℃靜止培養12h，再以10%接入量接入裝有100ml MRS液體培養基的250ml三角瓶中，36℃增菌培養12h。

紅曲霉：用無菌水洗下麥芽汁斜面培養基菌種，并刮下表面菌絲，接種到裝有100ml種子培養基的500ml三角瓶中，30℃、200r/min搖床培養2d。

1.2.2 紅曲霉發酵液制備

將培養好的種子液以10%接種量接入到裝有100ml發酵液培養基的500ml三角瓶中，30℃、200r/min搖床培養7d。

1.2.3 接種方式確定

（1）植物乳桿菌單菌發酵；（2）將乳酸菌與紅曲霉種子液同時接入到蜂花粉中發酵；（3）先將紅曲霉種子液接種到紅曲霉發酵液中搖瓶培養，將乳酸菌種子液接入到蜂花粉中，同時添加制備好的紅曲霉發酵液。以乳酸菌活菌數和蜂花粉pH值為參考指標，比較發酵效果。

1.2.4 蜂花粉發酵工藝條件的優化

根據單因素試驗結果確定乳酸菌接種量（%）、紅曲霉發酵液添加量（%）、加水量（%）、發酵溫度（℃）設計L9（34）正交試驗，以乳酸菌活菌數和感官評分為指標對發酵工藝進行優化。

1.2.5 蜂花粉乳酸菌計數

稱取5.0g發酵后的蜂花粉，十倍稀釋法制得適宜稀釋度的樣品稀釋液。選擇2～3個適宜稀釋度，分別吸取1 ml，傾注法接種到MRS培養基，36 ℃厭氧培養48h（每個稀釋度做兩個平板）。選取菌落總數在30CFU-300CFU之間的平板計數，取平均值[8]。

1.2.6 感官評定

參考“0-4評判法”[9]，請10名從事食品研究的工作者對各因素兩兩進行重要性比較，確定發酵蜂花粉感官評價時各因素的權重：A=[0.34，0.27，0.39]

以發酵蜂花粉的顏色、香氣和滋味三個因素為主要評價指標，每個指標滿分為5分。請10名食品感官質量考評員進行感官質量評價，評分標準見表1。

1.2.7 驗證試驗

表1 發酵蜂花粉感官評分標準

用正交試驗確定的最佳條件進行蜂花粉發酵，測定所的結果，比較其與試驗組的差異。

2 結果與分析

2.1 接種方式的確定

從表2中可知，同時發酵時，乳酸菌活菌數隨著發酵時間的延長而下降，分析原因可能是紅曲霉生長周期較長，其生長消耗蜂花粉中營養物質，乳酸菌不能進一步獲取足夠的營養物質而死亡；也有關于紅曲霉與乳酸菌之間存在相互抑制作用的報道[10]。同時，從表2中可以看出，添加紅曲霉發酵液對乳酸菌的生長有一定的促進作用，原因可能是紅曲霉發酵液的中含有蛋白酶、糖化酶等，能夠分解蜂花粉中的大分子營養物質，從而為乳酸菌生長代謝提供能量來源。綜合比較可知，最佳接種方式為先將紅曲霉種子液接種到紅曲霉發酵培養基進行搖瓶培養，將制備好的紅曲霉發酵液添加到蜂花粉中，接種乳酸菌種子液進行發酵。

2.2 乳酸菌接種量對發酵結果的影響

表2 不同接種方式的乳酸菌活菌數和蜂花粉pH值

表3 乳酸菌接種量對產品的活菌數和感官特征的影響

當乳酸菌接種量小于10%時，乳酸菌體數量較少，蜂花粉發酵不明顯，香氣和滋味都不理想，乳酸菌活菌數也較少；接種量達到10%時，蜂花粉發酵較充分，乳酸菌活菌數也較高，從節約成本的角度出發，確定乳酸菌接種量的最佳值為10%。

2.3 紅曲霉發酵液添加量對發酵結果的影響

添加量為5%時，蜂花粉中乳酸菌活菌數低，感官也較差，這可能是因為酶類物質不足，乳酸菌發酵受到限制。當添加量大于15%時，乳酸菌活菌數較高，但產品感官較差，原因可能有：1）紅曲霉發酵液顏色較深，添加量過多會影響產品色澤；3）紅曲霉發酵產生醬香氣；2）乳酸菌在酶類物質的幫助下，在蜂花粉中的存活時間延長，從而產酸多，使產品過酸。綜合以上原因，選擇10%為紅曲霉發酵液最佳添加量。

2.4 加水量對發酵結果的影響

由表5可知，隨著加水量的增加，蜂花粉中乳酸菌活菌數增加，但加水量大于20%后，蜂花粉香氣較弱。當加水量為20%時，乳酸菌活菌數高，感官特性也好，故選擇最佳加水量為20%。

表4 紅曲霉發酵液對產品的活菌數和感官特征的影響

表5 加水量對產品的活菌數和感官特征的影響

2.5 發酵溫度對發酵結果的影響

在一定范圍內，隨著溫度的升高，乳酸菌活菌數增加，36℃時達到最高峰。從感官角度考慮，溫度過低時發酵不充分，蜂花粉還帶有苦味，而過高時產品顏色較深，滋味也不佳。當發酵溫度為33℃時乳酸菌活菌數較高，感官特性好，因此選其為發酵最佳溫度。

2.6 發酵工藝條件正交試驗

正交試驗結果見表7。

從表中的極差分析可以看出，對乳酸菌活菌數的影響由大到小的順序為乳酸菌活菌數＞紅曲霉發酵液添加量＞加水量＞發酵溫度最優水平為A3B3C3D2。而影響產品感官分數的因素主次順序為乳酸菌活菌數＞紅曲霉發酵液接種量＞發酵溫度＞加水量，因素最優水平為A3B2C1D2。可見對于乳酸菌活菌數和感官分數而言，4個因素的影響程度不一致，最優方案也不同。為了進一步比較各因素水平的優先順序，分別以活菌數、感官分數極差值的平均值Ki為縱坐標，以各因素水平為橫坐標做圖（圖1和圖2）。

表6 發酵溫度對產品的活菌數和感官特征的影響

表7 L9(3)4正交試驗結果

圖1 乳酸菌活菌數隨各因素水平的變化趨勢

圖2 感官分數隨各因素水平的變化趨勢

結合圖5和6和極差分析，因素A對于兩個指標都是取A3好；因素B是兩個指標中較重要的因素，對于乳酸菌活菌數而言，取B3（13%）最好，但取B3時感官分數低。因此感官特征優先考慮選擇B2。因素C從乳酸菌活菌數角度出發，應取C3（15%），但對感官分數而言取C1好。由于因素C3對乳酸菌活菌數的影響大于對感官的影響，因此選擇C3。因素D對于兩個指標都是取D2好。綜合各個因素，發酵工藝的最佳組合為A3B2C3D2，即乳酸菌接種量13%，紅曲霉添加量10%，加水量25%，發酵溫度33℃。

2.7 驗證試驗

乳酸菌接種量13%，紅曲霉添加量10%，加水量25%，發酵溫度33℃ 進行油菜蜂花粉的發酵，產品的乳酸菌活菌數為2.2×107cfu/g，感官評分4.24，優于其他實驗組。

3 結論

采用從蜂糧中分離得到的植物乳桿菌可以對蜂花粉進行發酵。通過以乳酸菌活菌數和感官評分為試驗指標，在單因素基礎上對發酵工藝進行優化，正交試驗得到發酵工藝的最佳組合為乳酸菌接種量13%，紅曲霉發酵液添加量10%，加水量25%，發酵溫度33℃。發酵后的蜂花粉酸甜適口，且富含益生菌。

[1]黃文誠.微生物對蜂群營養和健康的重要性[J].中國蜂業,2010,61,(04):54-55.

[2]Ján Brindza1, Kamila Bacigálová, Peter Ferianc.Pollen microbial colonization and food safety.Acta Chimica Slovaca,2010,3(1):95-102.

[3]孫桂丹.四川泡菜中優良乳酸菌菌種的篩選及發酵條件初探[D].四川: 四川農業大學, 2007, 06:6-7.

[4]Z.Abouda,I.Zerdani,I.Kalalou.The antibacterial activity of Moroccan bee bread and bee-pollen(fresh and dried) against pathogenic bacteria.Research Journal of Microbiology[J].2011,6(4):376-384.

[5]Phikunthong Kopermsub, Sirinda Yunchalard.Identification of lactic acid bacteria associated with the production of plaa-som, a traditional fermented fish product of Thailand.[J].International Journal of Food Microbiology, 2010,138: 200-204.

[6]Abd El Gawad, Abd El Fatah, Al Rubayyi.Identification and characterization of dominant lactic Acid bacteria isolated from traditional Rayeb milk in Egypt[J].Journal of American Science 2010;6(10): 728-735

[7]朱軍,莉王曄,勵建榮.生物保鮮乳酸菌的篩選及其細菌特性的研究[J].中國釀造,2010(5):42-46.

[8]GB 4789.35—2010,食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗[S].

[9]徐樹來,王永華.食品感官分析與實驗[M]（第二版）.北京:化學工業出版社,2010.

[10]徐冬云.紅曲霉產降血壓活性物質的研究[D].浙江工業大學,2006,04:74-78.