鏈脲佐菌素誘導糖尿病恒河猴胰島細胞數量的變化

朱 華，徐艷峰，劉 穎，黃 瀾，秦 川

(衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，北京 100021)

胰腺分為外分泌腺和內分泌腺兩部分。外分泌腺分泌胰液，內分泌腺由大小不同的細胞團—胰島所組成，主要分泌胰島素，調節糖代謝。人和大、小鼠等實驗動物的胰島細胞按其染色和形態學特點，主要分為A細胞、B細胞、D細胞及 PP細胞，但各種細胞的比例不同。鏈脲佐菌素(STZ)能選擇性破壞B細胞而誘導不可逆糖尿病。本文在小劑量多次注射STZ成功誘導恒河猴糖尿病動物模型的基礎上，用免疫組化方法顯示各種胰島細胞的形態和數量變化，結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 模型制備

成年恒河猴5只，購自軍事醫學科學院實驗動物中心，年齡4～6歲，體重(5.5～6.5)kg。動物合格證號:SCXK-(軍)2007-001。動物使用許可證號:SYXK(京)2010-0030。模型制作方法見參考文獻［1］。

1.2 標本制備

模型動物中的3只在給予STZ 19個月，1只動物在給予STZ 20個月時處于瀕死狀態。動物經戊巴比妥麻醉后股動脈放血處死。取胰腺在10%中性甲醛固定，組織經常規脫水，石蠟包埋。櫻花IVS410切片機進行連續切片，厚度4 μm，每隔5片取連續的4片貼在防脫載玻片上，50℃烤箱內烘烤過夜。取毒性試驗正常對照組動物胰腺作為對照，切片處理與模型動物相同。

1.3 免疫組化染色

切片經脫蠟、水化、蒸餾水洗，進行 SP法免疫組化染色。步驟:(1)3%H2O2消除內源性過氧化物酶，室溫 10 min，PBS洗。(2)正常血清封閉 15 min，滴加第一抗體(rabbit anti-insulin，Santa公司產品，貨 號 SC-9618，稀 釋 度 1∶300;mouse antiglucagon，福建邁新，貨號 BM1621，稀釋度 1∶200;rabbit anti-somatostatin，北京中杉金橋，貨號 ZA-0232，稀釋度 1∶150;rabbit anti-polypeptide，北京中杉金橋，貨號 ZA-0211，稀釋度 1∶100)，4℃ 過夜，PBS洗。(3)滴加第二抗體(辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG聚合物，北京中杉金橋，貨號 PV-9001，PV-9002)，室溫孵育 30 min，PBS 洗。(4)DAB顯色1～5 min(北京中杉金橋，貨號 ZLI-0001)，顯微鏡下控制顯色程度，蒸餾水終止顯色。(5)蘇木素襯染后脫水、透明、中性樹膠封片。

1.4 細胞計數與統計學方法

切片光鏡下觀察后用Aperio切片掃描系統對切片進行掃描，隨機截取5個高倍視野(400×)，采用Image-Pro PLUS圖像分析系統對陽性細胞數和光密度值(IOD)進行分析。每只動物計數3張切片，取平均值。數據用SPSS16.0統計軟件處理，兩組間比較使用t檢驗，P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 各種細胞的比例

對照組組 A、B、D、PP四種細胞的比例約為21%、73%、5%、1%。模型組四種細胞的比例為58% 、32% 、8% 、2%(圖 1)。

圖1 胰島各細胞比例Fig．1 Percentage composition of the pancreas islet cells in the control and model groups．

2.2 免疫組化

結果可見B細胞胞質在對照組中呈深棕色，分布在胰島中央區。模型組中B細胞胞質著色變淺(圖2A，C)，胰島素表達減少。細胞核藍色。剩余細胞肥大，分布雜亂。模型組A細胞增生，細胞變密集，分布于胰島周邊部位，在模型組與對照組中均呈現為較深的棕色顆粒(圖2B，D，見彩插1)。對照組D細胞數量較少，分布在胰島 A、B細胞中間。模型組 D細胞增生，生長抑素表達增多(圖3A，C)。對照組PP細胞體積較小，數量極少，分布在胰島周邊部位。模型組PP細胞增生，胰多肽表達增多(圖3B，D，見彩插2)。

2.3 陽性細胞數及光密度值

模型組B細胞陽性細胞數及光密度值較對照組顯著減少(P＜0.01)。模型組A細胞陽性細胞數量及光密度值比對照組顯著增高(P＜0.01)。D細胞陽性細胞數量及光密度值比對照組增高，但差異無顯著性。模型組動物PP細胞顯著增生，陽性細胞數量及光密度值較對照組顯著增加(P＜0.05)(表 1)。

表1 胰島細胞表達情況及細胞光密度值Tab．1The expression of pancreatic islet cells and IOD of the two groups(ˉx±s，n=4)

3 討論

自80年代以來1型糖尿病的自身免疫學說已確立［2］。根據多方面的綜合研究，已知它是由T淋巴細胞介導的自身免疫性疾病。胰島B細胞受到自身免疫攻擊而選擇性地被破壞，胰島B細胞功能受損，胰島素分泌絕對或相對不足［3－5］。STZ是一種廣譜抗菌素，對大小鼠的胰腺B細胞具有選擇性毒性作用，可引起血糖升高及胰島萎縮等改變，但其發病機制及病理生理改變與人類糖尿病差別較大［6］。小劑量多次注射 STZ通過激活自身免疫過程導致B細胞損傷［7］，與 I型糖尿病的發病機理學說類似。本實驗的結果顯示，小劑量STZ作用于恒河猴胰腺18個月后，胰島B細胞數量明顯減少(P＜0.01)，胰島素表達降低，合成和分泌胰島素的功能減弱較正常動物明顯減弱。從組織學上證實此模型與人類糖尿病的相似性。

嚙齒類動物的胰腺中，A細胞占15% ～20%，B細胞占60% ～80%，D細胞少于10%，PP細胞不足1%［8］。而在人類胰島中，A、B、D、PP 四種細胞比例分別為20% ～25%，60% ～75%，5%和少于1%［9］。本實驗中，恒河猴胰島 D細胞、PP細胞比例與嚙齒類相差不大，而B細胞比例減少，A細胞比例增多，其細胞比例與人類更接近。

生理情況下，A細胞分泌的高血糖素與B細胞分泌的胰島素相互拮抗和協調維持了血糖的穩定。正常情況下胰島素作用占優勢。胰島素絕對或相對不足時，胰高血糖素作用加強而且可以直接作用于B細胞。反映在組織學上即表現為A細胞的增生和胰高血糖素的表達增加。胰島D細胞分泌的生長抑素是一種含14個氨基酸的肽類激素，可通過旁分泌發揮抑制糖吸收，調節糖代謝的作用。有文獻報道給予外源性生長抑素可預防STZ引起的胰島素分泌障礙［10］。胰島素分泌不足時，D細胞代償性增生。本實驗結果顯示恒河猴胰島A細胞數量顯著增加，胰高血糖素表達增多(P＜0.01)。D細胞的數量級表達情況雖然沒有統計學意義，但與對照組相比仍有上升趨勢。與文獻報道相符。

本文在使用STZ成功誘導恒河猴糖尿病動物模型后，利用免疫組化方法顯示恒河猴動物模型胰島各種細胞的數量和激素表達情況，證實其數量及表達與人類糖尿病類似，為模型的應用提供參考。

［1］ 朱華，劉穎，馬春梅，等．STZ誘導恒河猴糖尿病動物模型的建立［J］．中國比較醫學雜志，2012，22(6):53－56．

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