hSRD5A2體外藥物篩選新模型的建立及在篩選藥物上的應用

汪洋，汪興生（1.馬鞍山市醫療集團，安徽馬鞍山243000；2.安徽中醫學院藥學院，合肥230038）

hSRD5A2體外藥物篩選新模型的建立及在篩選藥物上的應用

汪洋1＊，汪興生2#（1.馬鞍山市醫療集團，安徽馬鞍山243000；2.安徽中醫學院藥學院，合肥230038）

目的：建立人類類固醇5αlphaⅡ型還原酶（hSRD5A2）體外藥物篩選新模型，并用于中藥提取物的篩選。方法：在體外建立hSRD5A2抑制劑模型，hSRD5A2、睪酮（T）和還原型輔酶Ⅱ（NADPH）一起組成了一個微量反應系統，對底物濃度、NADPH、hSRD5A2、溫度和時間進行優化，并利用建立的模型篩選中藥提取物。結果：當固定底物、NADPH、hSRD5A2的濃度分別為0.02μmol·L－1、0.8mmol·L－1、0.05u·mL－1時，在37℃反應60min，hSRD5A2達到了最大活性；芒果苷有顯著抑制hSRD5A2活性的作用。結論：本研究建立的模型是一種簡單可靠的篩選hSRD5A2抑制劑的方法；芒果苷可能成為一種治療良性前列腺增生的藥物。關鍵詞 人類類固醇5αlphaⅡ型還原酶；良性前列腺增生；中藥提取物；芒果苷；體外藥物篩選模型

良性前列腺增生（Benign Prostate Hyperplasia，BPH）是前列腺尿道周圍區細胞的良性腺瘤性增生[1]，是老年男性常發病。研究表明，BPH可能是患者類固醇5αlphaⅡ型還原酶（hSRD5A2）過度表達的結果[2]。hSRD5A2作用產生的雙氫睪酮（DHT）在BPH發病機制中起主要作用，而人類類固醇5α lphaⅠ型還原酶產生的DHT作用很小[3]。非那雄胺是hSRD5A2抑制劑，治療BPH安全有效[4]。本研究擬建立一種新的hSRD5A2抑制劑模型來篩選一些中藥提取物，為研究抗BPH藥物奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

GL21M型離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）；ZF-1型三用紫外分析儀（上海精科實業有限公司）；202-1A型數顯電熱恒溫干燥箱（上海陽光實驗儀器有限公司）；ZD-88B型恒溫搖床（太倉市博萊特實驗儀器廠）；DNP-9052型電熱恒溫培養箱（上海三發科學儀器有限公司）；DYY-604型穩壓穩流電泳儀（南京新校園生物科技研究所）；TC-25H型PCR儀（美國Thermo Electron公司）；SW-CJ-1F型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；凝膠成像系統（德國UVP公司）；超聲波細胞粉碎儀（上海比朗儀器有限公司）；ELx800型酶標儀（美國Bio-Tek公司）。

1.2 試藥

芒果苷提取物從中國植物多樣性研究中心購買，其他中藥提取物由安徽中醫學院植物化學組提供并鑒定。質粒PcDNA3.1（+）、限制性內切酶BamHⅠ、XhoⅠ、Taq DNA聚合酶、DNA Marker、Protein Marker、腸激酶（EK酶）、0.1%牛血清白蛋白（大連寶生物工程有限公司）；質粒DNA小量試劑盒（愛思進生物技術（杭州）有限公司）；酵母提取物、蛋白胨（英國Hampshire公司）；谷胱甘肽S-轉移酶（瑞士GE公司）；還原型谷胱甘肽（南京生興生物技術有限公司）；非那雄胺、苯甲基磺酰氟（美國Biosharp公司）。

1.3 細胞與細菌

CHO細胞、大腸桿菌DH5α、pMD 18-T由安徽中醫學院生物藥劑實驗室提供。

2 方法

2.1 建立hSRD5A2抑制劑篩選的模型

本研究室利用細胞培養、基因工程、Ni純化等技術，獲得高純度hSRD5A2（含量：98%），置于96孔板，對照孔和試驗孔重復3個，hSRD5A2、睪酮（T）和其他試劑一起有序地加入孔中進行反應，反應溫度為37℃，反應時間為60min。反應結束后，反應的200μL液體轉至其他96孔板的孔中。根據說明書的要求，DHT產量由EIA法測定；hSRD5A2的活性由DHT的產量來恒定。對還原型輔酶Ⅱ（NADPH）、hSRD5A2、T、時間和溫度在微型反應體系中進行優化，建立體外篩選hSRD5A2抑制劑的模型。非那雄胺被選為hSRD5A2抑制劑的陽性對照，乙醇為陰性對照，通過上述方法評價篩選hSRD5A2抑制劑的模型。

2.2 中藥提取

取各中藥提取物，粉碎后以乙醇提取。乙醇提取物在真空蒸發器中濃縮，浸膏稱重，用50%乙醇溶解成濃度為1%的溶液。

2.3 統計學方法

3 結果

3.1 T、NADPH、hSRD5A2濃度對hSRD5A2活性的影響

hSRD5A2反應體系由T、NADPH、hSRD5A2和磷酸鉀緩沖液（pH7.0）組成。為了確定反應系統中T的最適濃度，固定hSRD5A2、NADPH的濃度和溫度，研究T濃度與DHT產量的變化關系，可確認最佳的T濃度為0.02μmol·L－1。NADPH以不同濃度加入反應體系中，固定T和其他底物濃度不變，2h后通過EIA法檢測DHT的產量。當NADPH的濃度為0.8mmol·L－1時，DHT的產量達到最高值，可確定NADPH的最適濃度為0.8mmol·L－1。為了確定反應體系中hSRD5A2的最適濃度，固定NADPH、T的濃度和溫度，發現DHT產量的變化與hSRD5A2濃度的變化有關，可確定反應體系中hSRD5A2的最佳濃度為0.05u·μL－1。不同濃度的T、NADPH、hSRD5A2對hSRD5A2活性的影響分別見圖1～圖3。

圖1 不同濃度的T對hSRD5A2活性的影響Fig 1 Effects of different concentrations of T on the activity of hSRD5A2

圖2 不同濃度的NADPH對hSRD5A2活性的影響Fig 2Effects of different concentrations of NADPH on the activity of hSRD5A2

圖3 不同濃度的hSRD5A2對hSRD5A2活性的影響Fig 3 Effects of different concentrations of hSRD5A2on the activity of hSRD5A2

由圖1可知，當T濃度從0增加至0.02μmol·L－1時，DHT產量與T濃度增加成線性相關。當T的濃度增加至2.5、3.0、3.5μmol·L－1時，DHT產量不變，達到最高值。

由圖 2可知，NADPH 的濃度以 0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mmol·L－1分別加到反應體系的板孔中，當NADPH濃度從0.05mmol·L－1升至0.8mmol·L－1時，NADPH濃度與DHT產量成線性相關。結果表明，NADPH濃度與hSRD5A2的活性相關，高濃度的NADPH大大提高了hSRD5A2的活性，另外T轉化為DHT的產量也相應提高。

由圖3可知，當hSRD5A2濃度從0提高至0.05u·μL－1時，hSRD5A2濃度同DHT產量成線性關系，高濃度的hSRD5A2增加了DHT產量。當hSRD5A2濃度為0.05u·μL－1時，DHT產量顯示最高值（規定0.00082g hSRD5A2為1u）。

3.2 時間和溫度對hSRD5A2活性的影響

為了確定反應體系中最適反應溫度和時間，固定hSRD5A2和NADPH濃度。2h后，當溫度為37℃時，DHT產量達到峰值；以后，隨著溫度增加，DHT的產量逐漸下降。不同反應溫度對hSRD5A2活性的影響見圖4。另一方面，當反應溫度為37℃，反應時間達到60min時，DHT產量達到最高值，隨著反應時間加長，DHT產量不會增加。不同反應時間對hSRD5A2活性的影響見圖5。

圖4 不同反應溫度對hSRD5A2活性的影響。Fig 4 Effects of different reaction temperatures on the activity of hSRD5A2

圖5 不同反應時間對hSRD5A2活性的影響。Fig 5 Effects of different reaction time on the activity of hSRD5A2

3.3 一些中藥提取物對hSRD5A2活性的抑制作用

筆者確定了hSRD5A2、NADPH、T濃度以及時間和溫度。當非那雄胺的濃度從0.005μmol·L－1升至0.16μmol·L－1時，DHT含量與非那雄胺的濃度成線性關系。筆者篩選了大約20種中藥提取物，如梔子苷、苦參生物堿、莪術醇、芒果苷、小檗堿、肉桂酸等，發現梔子苷、鎖陽、紫莖澤蘭、松樹葉、黃芩苷、黃連、滿杜鵑皮的水提物和醇提物對hSRD5A2沒有或有非常弱的抑制作用（數據無顯示）。芒果苷對hSRD5A2有顯著的抑制作用，且該抑制作用明顯優于新芒果苷，但兩者都比非那雄胺弱。不同濃度的芒果苷對hSRD5A2活性的影響見圖6。

圖6 不同濃度的芒果苷對hSRD5A2活性的影響。Fig 6Effects of different concentrations of mangiferin on the activity of hSRD5A2

4 討論

據報道，前列腺增生酶的體外模型是通過將鼠的同源組織勻漿化，其中混合了SRD5A1和SRD5A2，以及內源性NADPH[5]，或建立穩定表達hSRD5A2的細胞株作為抑制篩選模型[6]。筆者認為目前的研究有其局限性，hSRD5A2通過克隆和純化獲得，采用了外源性NADPH，這個反應系統的關鍵影響因素被分離開了。本試驗中，筆者對底物、NADPH、hSRD5A2濃度與溫度以及時間進行了優化。根據不同的pH值，hSRD5A2抑制劑的靈敏度是不同的，所以筆者選擇中性作為hSRD5A2工作的最佳環境[7]。本研究建立了更可靠方便的BPH抑制劑的篩選模式。

在本研究中，確定了知母根提取物中的芒果苷對hSRD5A2具有抑制作用。另據報道，芒果苷具有抗氧化活性，能抑制誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的表達和提高轉化生長因子的表達，芒果苷對hSRD5A2的抑制作用是由于直接抑制hSRD5A2本身，而不是其非特異性抗氧化劑的潛力[8]。不過，也有可能是知母提取物的其他化合物可以競爭或非競爭性抑制造成的。其活性成分及其分子作用機制有待進一步研究。

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Establishment andApplication of in Vitro Novel Selection Model for hSRD5A2in Drug Selection

WANG Yang（Maanshan Municipal Hospital Group，Anhui Maanshan 243000，China）
WANG Xing-sheng（School of Pharmacy，Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230038，China）

OBJECTIVE：To establish a novel selection model for hSRD5A2in vitro，and apply it for the selection of TCM extracts.METHODS：The in vitro model for screening hSRD5A2inhibitor had been established，hSRD5A2and testosterone（T）as a substrate together with NADPH as a hydrogen supplier，were composed of a minim reactive system.The concentrations of substrate，NADPH and hSRD5A2，temperature and time were all optimized，and established model was used to screen TCM extract.RESULTS：When the concentrations of substrate，NADPH，hSRD5A2were 0.02μmol·L－1，0.8mmol·L－1and 0.05u·mL－1respectively，the maximum activity of hSRD5A2were achieved at 37℃ after 60min reaction，mangiferin has significant inhibitory effect on the activity of hSRD5A2.CONCLUSION：The model in this study is a convenient and reliable for screening hSRD5A2inhibitors，and mangiferin may be a potential medicine for curing the benign prostatic hyperplasia.

hSRD5A2；Benign prostatic hyperplasia；TCM extract；Mangiferin；In vitro drug screening model

R969.1；R971+.1

A

1001-0408（2012）31-2902-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.31.08

2011-11-06

2012-03-27）