鴨源大腸桿菌和沙門菌混合感染的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

林 安，喻 元，胡嵐嵐，伍 莉，2

（1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌402460；2.重慶市獸藥工程技術(shù)研究中心，重慶 北碚400715）

近年來，為控制與大腸桿菌和沙門菌感染有關(guān)的禽類死亡，某些抗菌藥物在臨床上進(jìn)行了廣泛使用，這不可避免地導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性。為了解和掌握鴨大腸桿菌和沙門菌混合感染的情況以及耐藥程度，為臨床上有效預(yù)防和治療藥物的篩選提供依據(jù)，本試驗(yàn)對(duì)榮昌縣某鴨場(chǎng)發(fā)病雛鴨分離的細(xì)菌進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室診斷和藥敏試驗(yàn)，以期望為更有效地防控該病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 采集重慶市榮昌縣某鴨場(chǎng)病死雛鴨的肝、脾臟等組織，低溫保存送回實(shí)驗(yàn)室待檢。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 普通瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、S.S.培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基、細(xì)菌微量生化鑒定管（批號(hào)：101226）、藥敏紙片（批號(hào)：110104）、腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定編碼冊(cè)（第二代GYZ－15e），均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 昆明系健康小鼠16只，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重18.0～22.0g，雌雄各半；購(gòu)自榮昌縣某孵化場(chǎng)的2日齡健康花邊雛鴨40只，雌雄各半，觀察2d后用于動(dòng)物回歸試驗(yàn)。

1.4 細(xì)菌的分離、純化 將采集的病料接種于普通瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24h，選取疑似菌落進(jìn)行分離菌的抹片，革蘭染色，鏡檢。于菌種管內(nèi)取菌液在S.S.培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行劃線，37℃培養(yǎng)18～24h，觀察菌落生長(zhǎng)特點(diǎn)［4］。

1.5 生化試驗(yàn) 將分離菌株活化后接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，進(jìn)行15項(xiàng)生化試驗(yàn)，參照腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定編碼冊(cè)（第二代GYZ－15e）計(jì)算編碼值，確定細(xì)菌種類。

1.6 致病性試驗(yàn) 16只健康小鼠分成4組，每組4只，1組腹腔注射大腸桿菌菌懸液0.2mL／只（2×1010CFU／mL）；2組腹腔注射沙門菌菌懸液0.2mL／只（2×1010CFU／mL）；3組同時(shí)腹腔注射沙門菌和大腸桿菌菌懸液各0.1mL／只；4組為對(duì)照組，腹腔注射滅菌普通肉湯0.2mL／只。對(duì)注射后的小鼠隔離飼養(yǎng)，觀察其發(fā)病及死亡情況［2］，并從死亡小鼠的肝、脾組織中回收細(xì)菌進(jìn)行生化試驗(yàn)，判斷細(xì)菌種類。

1.7 藥敏試驗(yàn) 采用WHO推薦的K－B紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行［3］，按臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所（CLSI）2010年標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。

1.8 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 40只2日齡雛鴨飼養(yǎng)2d后分為4組，每組10只。1組腹腔接種沙門菌菌懸液0.5mL／只（2×1010CFU／mL）；2組腹腔接種大腸桿菌菌懸液0.5mL／只（2×1010CFU／mL）；3組分別腹腔接種大腸桿菌和沙門菌菌懸液各0.25mL／只；4組為對(duì)照組，腹腔注射滅菌普通肉湯0.5mL／只。對(duì)注射后的雛鴨隔離飼養(yǎng)，觀察其發(fā)病及死亡情況，并對(duì)死亡雛鴨立即剖檢，觀察病理學(xué)變化。無菌采取死亡雛鴨的肝、脾組織，涂片、染色、鏡檢，并在麥康凱瓊脂上劃線分離，37℃培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)、大小。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離、純化 病料在培養(yǎng)基上分離出A、B兩種菌株。普通瓊脂上：A菌為圓形、表面光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊、灰白色半透明、中等大小的菌落；B菌為圓形、表面光滑、邊緣整齊、無色半透明、中等大小的菌落。在麥康凱瓊脂平板上：A菌形成較大、紅色、圓形、邊緣整齊、中央隆起的菌落；B菌形成中等、無色透明、邊緣整齊、中央隆起的菌落。在S.S.瓊脂上：A菌形成圓形、中心混濁的紫紅色菌落；B菌形成圓形、透明的無色菌落。把兩種細(xì)菌進(jìn)行鏡檢：A菌為革蘭陰性、中等大小、兩端略圓的短粗桿菌，呈單個(gè)存在、也有成雙排列；B菌為革蘭陰性、較前者大、直桿菌。鏡檢后將兩種菌分別接種于麥康凱培養(yǎng)基和S.S.培養(yǎng)基中，讓其純化生長(zhǎng)，然后將純化的兩種菌分別接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中作增菌培養(yǎng)，接種A菌的肉湯呈均勻混濁，管底有絮狀沉淀，液面有菌環(huán)；接種B菌的肉湯呈均勻混濁，管底有絮狀沉淀，液面無菌環(huán)。

2.2 生化試驗(yàn) 生化試驗(yàn)結(jié)果見表1。參照腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定編碼（第二代GYV－15e），結(jié)合細(xì)菌的生化試驗(yàn)與分離特性，判定A菌為大腸埃希菌（編碼值：06174），B菌為豬霍亂沙門菌（編碼值：42165）。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）

2.3 致病性試驗(yàn) 小鼠接種細(xì)菌24h后，1組死亡3只，2組死亡2只，3組全部死亡，4組小鼠健康存活，未出現(xiàn)發(fā)病或死亡現(xiàn)象。死亡鼠剖檢變化典型，并從肝、脾組織中回收細(xì)菌，通過麥康凱培養(yǎng)基培養(yǎng)、生化鑒定、鏡檢等檢出的兩種細(xì)菌和原分離的兩種菌株一樣，即A菌為大腸埃希菌，B菌為豬霍亂沙門菌。

2.4 藥敏試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果見表2。大腸桿菌對(duì)氨芐西林等7種抗菌藥物高敏；對(duì)阿莫西林中敏；對(duì)恩諾沙星等6種藥物耐藥。沙門菌對(duì)慶大霉素等7種藥物高敏；對(duì)強(qiáng)力霉素中敏；對(duì)氧氟沙星等6種藥物耐藥。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，對(duì)大腸桿菌和沙門菌都高度敏感的藥物有頭孢唑啉、慶大霉素、鏈霉素、大觀霉素、多黏菌素B等5種抗菌藥物，它們可作為該養(yǎng)鴨場(chǎng)防治鴨源大腸桿菌和沙門菌混合感染的首選藥物。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

大腸桿菌對(duì)恩諾沙星等6種藥物耐藥，沙門菌對(duì)氧氟沙星等6種藥物耐藥。兩種細(xì)菌均對(duì)氟喹諾酮類的諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星和磺胺類的復(fù)方新諾明具有很強(qiáng)的耐藥性；多重耐藥譜顯示，大腸桿菌呈現(xiàn)四重耐藥，沙門菌呈現(xiàn)三重耐藥。

2.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 雛鴨感染細(xì)菌后24h后開始出現(xiàn)臨床癥狀，甚至死亡。48h后，1組死亡7只，2組死亡8只，3組全部死亡，4組未出現(xiàn)發(fā)病或死亡。分別從病死雛鴨的肝、脾組織接種細(xì)菌，通過麥康凱培養(yǎng)基培養(yǎng)、生化鑒定、鏡檢等檢出的兩種菌和原分離的兩種菌株一樣，即A菌為大腸埃希菌，B菌為豬霍亂沙門菌。

3 分析與討論

本試驗(yàn)分離到的鴨源大腸埃希氏菌和豬霍亂沙門菌，均具有較強(qiáng)的致病性。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌對(duì)頭孢唑啉、慶大霉素、鏈霉素、大觀霉素、多黏菌素B等5種抗菌藥物高敏，它們可作為該場(chǎng)防治大腸桿菌和沙門菌混合感染的首選藥物。兩種細(xì)菌均對(duì)氟喹諾酮類的諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星和磺胺類的復(fù)方新諾明具有很強(qiáng)的耐藥性，因此，臨床上該場(chǎng)要禁用上述耐藥性藥物。

在應(yīng)用抗生素治療細(xì)菌感染時(shí)，要有明確的臨床指征［4］。應(yīng)根據(jù)臨床癥狀、病例剖檢，再結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合診斷，找出病原，合理選擇用藥，不可在不明病因的情況下盲目用藥。臨床實(shí)踐證明，長(zhǎng)時(shí)間單用一種藥物防治某種疾病，不僅治療效果不佳，而且容易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，而適當(dāng)?shù)穆?lián)合使用敏感的抗生素能達(dá)到療效協(xié)同或相加，減少毒性，防止或延緩耐藥菌株產(chǎn)生的目的。

根據(jù)本次試驗(yàn)結(jié)果，建議該養(yǎng)鴨場(chǎng)應(yīng)定期分離雛鴨大腸桿菌和沙門菌的優(yōu)勢(shì)菌株，及時(shí)對(duì)產(chǎn)蛋鴨和雛鴨進(jìn)行免疫接種；臨床用藥以藥敏試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，采用多途徑、聯(lián)合、交叉等合理用藥方案，加上科學(xué)的飼養(yǎng)管理，搞好環(huán)境衛(wèi)生等多方面的措施，才能收到良好效果。此外，對(duì)該類細(xì)菌性疾病的防制不能完全依賴藥物治療或預(yù)防，應(yīng)該把重點(diǎn)放在強(qiáng)化生物安全措施、改善飼養(yǎng)管理?xiàng)l件上。經(jīng)常保持舍內(nèi)的環(huán)境干燥、衛(wèi)生、溫度和濕度適宜，空氣清新，喂飼易消化吸收的全價(jià)飼料，供給多種維生素，以預(yù)防為主，治療為輔。

［1］陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)［M］.3版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001：215－231.

［2］姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006：36－42.

［3］桂炳東，孫敬，徐建民.細(xì)菌藥物敏感性試驗(yàn)測(cè)定手冊(cè)［M］.南昌：江西科學(xué)技術(shù)出版社，2001：28－29.

［4］劉山輝.抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)方法［J］.吉林畜牧獸醫(yī)，2003，24（12）：49－50.