鴨髓樣分化因子MyD88部分cDNA克隆及組織表達(dá)圖譜分析

郭智莉，周作勇，聶 奎

（1.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 北碚400715；2.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌402460）

髓樣分化因子MyD88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）最初被認(rèn)為是一種髓樣分化標(biāo)記蛋白。1990年，Load發(fā)現(xiàn)了髓樣分化基因家族成員中的新基因MyD88［1］。MyD88是Toll樣受體（Toll－like receptors，TLRs）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)接分子，具有使核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor κB，NF－κB）活化轉(zhuǎn)位進(jìn)核，表達(dá)一系列特定的基因和致炎因子，如 TNF－α、IL－1和IL－18等。MyD88基因編碼蛋白具有3個(gè)功能區(qū)域：N端的死亡結(jié)構(gòu)域、中間區(qū)域及c端的TIR結(jié)構(gòu)域。有文獻(xiàn)表明，MyD88作為胞內(nèi)能夠介導(dǎo)10個(gè)TLRs家族的信號(hào)傳導(dǎo)［2］。在人和鼠TLRs研究中發(fā)現(xiàn)，MyD88激活NF－κB途徑介導(dǎo)了系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的發(fā)生［3］，還導(dǎo)致心肌肥大［4］、參與了呼吸道炎癥反應(yīng)［5］和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成［6］等。

迄今為止，多個(gè)哺乳動(dòng)物、魚類、鳥類和無脊椎動(dòng)物的MyD88分子已被鑒別，但是有關(guān)鴨的MyD88分子卻未見報(bào)道。本試驗(yàn)以櫻桃谷鴨為試驗(yàn)對(duì)象，對(duì)鴨MyD88部分cDNA進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)分析，并對(duì)MyD88mRNA在鴨不同組織中的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 10日齡櫻桃谷鴨，購自重慶榮昌某鴨廠。

1.2 主要試劑 大腸埃希菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存；RNAisoTMPlus、Taq酶、pMD 19－T、X－gal、RTPCR試劑盒、Amp，購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒，購自O(shè)MEGA公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank中已發(fā)表的雞（NM＿001030962）、人（NM＿001172568）、家鼠（NM＿198130）的 MyD88CDS序列，用DNAStar軟件進(jìn)行相似比對(duì)，在保守序列中用Primer5.0設(shè)計(jì)cDNA 引物，MyD88：F0 5′－GTTGGAGCAAACGGAGTTCA－3′，R0 5′－CCTGGGGAAAGACTAAGAGCA－3′，擴(kuò)增片段為195bp；參照鴨（AY43－6595）GAPDH 基因序列設(shè)計(jì)引物，GAPDH：F1 5′－GCCCAGAACATTATCCCA－3′， R1 5′－AGGTCAGGTCCACGAACA－3′，擴(kuò)增片段為152bp；由Invitrogen（上海）公司合成引物。

1.4 總RNA的提取 采鴨心臟、肝臟、脾臟等7種組織各0.1g。參照TaKaRa公司的RNAisoTMPlus試劑說明書提取各組織的總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA完整性。－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 RT－PCR擴(kuò)增 以鴨組織總RNA為模板，按RT－PCR的方法擴(kuò)增目的片段。cDNA反轉(zhuǎn)錄體系（10μL）：5×Prime ScriptTMBuffer 2μL，Prime ScriptTMRT Enzyme Mix I 0.5μL，Oligo dT Primer（50μmol／L）0.5μL，Random 6mers（100μmol／L）0.5μL，Total RNA 3μL，RNase Free dH2O 3.5μL，37℃15min，85℃5s。PCR體系（25μL）：cDNA 2μL，10×Buffer 2.5μL，dNTP Mixture 0.5μL，Mg2＋1μL，引物F和 R各加入0.5μL，rTaq酶0.25μL，滅菌dH2O至25μL；擴(kuò)增參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min；94℃30s，60℃30s，72℃30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。

1.6 目標(biāo)基因的克隆及測序 將50μL RT－PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后，按膠回收試劑盒回收目的片段。連接體系（10μL）：4.2μL回收產(chǎn)物，0.8μL pMD 19－T，5μL SolutionⅠ，混勻4℃連接過夜；轉(zhuǎn)化入100 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30min，42℃熱沖擊90 s，冰浴2min，加入890μL LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1.5h后將菌液涂于含IPTG＋X－gal＋Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)；挑選陽性單菌落接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩過夜，菌液PCR鑒定后，送陽性克隆至Invitrogen（上海）公司測序。

1.7 序列分析 將測序所得部分cDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST初步比較分析，利用DNAStar軟件推測目的片段所編碼的氨基酸序列，并用Clustal W方法比對(duì)目的氨基酸片段與其他物種MyD88氨基酸片段的同源性，建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 鴨MyD88RT－PCR檢測結(jié)果 以鴨脾臟cDNA為模板，采用RT－PCR方法擴(kuò)增MyD88目的片段，經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)1條特異性條帶，長度為195bp（圖1）。將純化的目的片段克隆到載體，重組質(zhì)粒經(jīng)菌液PCR鑒定，得到預(yù)期大小目的片段，命名為pMyD88。

圖1 MyD88部分基因RT－PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 MyD88測序及分析 陽性質(zhì)粒測序后得到195bp的pMyD88基因序列：

GTTGGAGCAAACGGAGTTCAAGCTGAAGCTCT GTGTCTTTGACCGGGACGTCTTGCCAGGAACG TGCGTGTGGTCCATCAGCGGAGAGCTTATAGA AAGGAGGTGTCGGAGGATGGTGGTCGTCATTT CAGACGATTACCTGGAAAGCGACGAATGCGAC TTTCAGACCAAATTTGCTCTTAGTCTTTCCCCA GG

在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST初步比較分析發(fā)現(xiàn)，pMyD88基因序列與G.gallus（NM＿001030962.1）、M.gallopavo（XM＿003206927.1）、T.guttata（XM＿002196725.1）、R.norvegicus（NM＿198130.1）、H.sapiens（NM＿001172568.1）的相似性分別為92%、92%、89%、78%、76%。

2.3 MyD88氨基酸同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 由pMyD88基因序列推導(dǎo)的氨基酸序列經(jīng)BLAST分析，該cDNA部分基因位于編碼MyD88分子TIR結(jié)構(gòu)域內(nèi)，與GenBank登錄的其他物種相應(yīng)MyD88TIR域氨基酸序列作同源性比對(duì)結(jié)果表明（圖2），鴨 MyD88與雞、火雞、珍珠鳥的同源性最高，為97%～100%；與人、鼠、牛、豬、狗、馬、兔、鯉魚的同源性為83%～84%；與綿羊的同源性為 79%。

圖2 pMyD88推導(dǎo)氨基酸序列與其他物種間的同源性比較

DNAStar軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（圖3），結(jié)果表明：鴨 MyD88與雞的親緣關(guān)系最接近，與火雞、珍珠鳥的較為接近，與狗、鼠、兔、人、豬、馬、綿羊、牛的親緣關(guān)系依次漸遠(yuǎn)，與鯉魚的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；其中鴨與雞、火雞在分化年限上最接近，說明他們的MyD88有密切關(guān)系。

圖3 pMyD88推導(dǎo)氨基酸序列與其他物種間的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 MyD88在鴨組織中分布 RT－PCR結(jié)果顯示，以持家基因GAPDH為參照，MyD88基因在鴨心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腔上囊中均有表達(dá)，且表達(dá)量存在差異，在腎臟、腦中未見轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（圖4）。

圖4 鴨MyD88mRNA在組織中的轉(zhuǎn)錄情況

3 討論

MyD88屬于Toll／IL－lR家族和死亡結(jié)構(gòu)域家族成員，MyD88的TIR結(jié)構(gòu)域與TLRs和IL－1Rs的TIR相結(jié)合從而介導(dǎo)下游信號(hào)傳導(dǎo)，最終誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子如IL－1、IL－6、IL－8、IL－12、TNF－α、干擾素和粘附因子等基因的表達(dá)，而通過抑制MyD88來減少細(xì)胞因子的表達(dá)能抑制疾病的發(fā)展［7］。MyD88分子在進(jìn)化過程中具有較高的保守性，在各物種間TIR結(jié)果域的同源性明顯高于死亡結(jié)構(gòu)域。李強(qiáng)等［8］克隆出豬MyD88完整的CDS序列，與人、牛、小鼠和褐鼠的MyD88分子對(duì)比后同源性在78.2%～88.4% 之間。Yafeng Qiu等［9］得出雞MyD88氨基酸序列與人、鼠MyD88同源性在70%左右。現(xiàn)還未見有關(guān)于鴨MyD88的研究，本試驗(yàn)克隆出鴨MyD88部分cDNA序列，氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，鴨MyD88TIR結(jié)構(gòu)域與禽鳥類同源性較高，在進(jìn)化中有較高的保守性。

早期的研究認(rèn)為，MyD88僅在骨髓組織中表達(dá)［1］，但后來研究證明，MyD88可在哺乳動(dòng)物的非骨髓組織中表達(dá)，且不同組織表達(dá)水平存在一定的差異，而且與動(dòng)物年齡也有一定的關(guān)系［10］。以熱滅活嗜水氣單胞菌刺激中華鱉后48h內(nèi)，肝、脾和腎組織中MyD88mRNA相對(duì)表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度的增加［11］。本試驗(yàn)檢測到鴨的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腔上囊均有MyD88mRNA轉(zhuǎn)錄，在腎臟、腦中未檢測到，且不同組織中MyD88的表達(dá)豐度存在差異，表明MyD88分布于鴨的周圍免疫器官、消化器官、呼吸器官、循環(huán)器官。提示MyD88在不同種屬動(dòng)物及不同組織部位具有生物多樣性。

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