牛新孢子蟲(chóng)內(nèi)標(biāo)多重PCR檢測(cè)方法的試驗(yàn)

唐慧芬，季新成，于學(xué)輝

（1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子832000；2.新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局，新疆 烏魯木齊830063）

新孢子蟲(chóng)病（Neosporasis）是犬新孢子蟲(chóng)（Neosporacaninum，N.caninum）寄生于宿主體內(nèi)引起的一種機(jī)會(huì)性原蟲(chóng)病，牛、羊、馬、鹿等均可作為中間宿主，終末宿主是犬，雖然該病可引起多種家畜共患，但對(duì)牛的危害更大，主要造成懷孕母牛流產(chǎn)、產(chǎn)死胎以及新生兒的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)疾病。該病呈世界性分布，給畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重的危害［1－2］，我國(guó)也有該病發(fā)生的報(bào)道［3］。迄今為止，還沒(méi)有防治新孢子蟲(chóng)病的有效藥物和疫苗，高效快速的檢測(cè)方法對(duì)于該病的防控至關(guān)重要。PCR方法具有快速、靈敏、高效等優(yōu)點(diǎn)，已有很多采用該方法檢測(cè)此病的報(bào)道［2，4］，但都是針對(duì)單個(gè)基因的檢測(cè)，且沒(méi)有對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。多重PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)展起來(lái)的一種技術(shù)，在一個(gè)反應(yīng)管中使用多對(duì)引物，實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)基因的同步檢測(cè)［5］，克服了單基因檢測(cè)可能造成漏檢的弊端。本試驗(yàn)以牛新孢子蟲(chóng)基因組中保守的NcSAG1基因、Nc－5基因和NcSRS2基因同時(shí)作為檢測(cè)的目的基因，并以牛性腺基因（prolactin）作為內(nèi)標(biāo)，在實(shí)現(xiàn)多基因檢測(cè)的同時(shí)，通過(guò)內(nèi)標(biāo)引物對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行監(jiān)測(cè)，為牛新孢子蟲(chóng)病的快速檢測(cè)提供更為準(zhǔn)確的方法。

1 材料與方法

1.1 陽(yáng)性核酸、樣品及相關(guān)對(duì)照 犬新孢子蟲(chóng)陽(yáng)性核酸，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院劉群教授惠贈(zèng)；?？鼓土鳟a(chǎn)胎兒組織等樣品，采自新疆不同牛場(chǎng)；牛皰疹病毒I型等病原陽(yáng)性核酸，由新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑TaqDNA 聚合酶（5U／μL）、DL－2 000DNA Marker、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ等，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、高純質(zhì)粒小量制備試劑盒、全血基因組DNA提取試劑盒和DNA zol，購(gòu)自百泰克生物技術(shù)（北京）有限公司；PGM－T載體，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；引物由上海生工生物有限公司合成。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NcSAG1基因、NC－5基因和NcSRS2基因以及prolactin基因，各設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度分別為201 bp、231bp、256bp和156bp。基因名稱及引物序列見(jiàn)表1。

表1 基因名稱及引物序列

1.4 模板DNA的制備 抗凝全血按照全血基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作；流產(chǎn)胎兒組織先經(jīng)液氮研磨，然后按照DNA zol基因組DNA快速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。DNA溶于50 μL TE溶液中，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 單重PCR反應(yīng)的優(yōu)化 采用25μL反應(yīng)體系：dNTP 終濃度分別為 1.0，1.5，2.0 和 2.5 mmol／L，引物終濃度分別為0.2，0.4，0.6和0.8 μmol／L，Mg2＋終濃度分別為1.0，1.5，2.0和2.5 mmol／L，TaqDNA 聚合酶終濃度分別為 0.75，1.0，1.25和1.5U，退火溫度分別為56℃，58℃和61℃，循環(huán)參數(shù)分別為30，35和40，優(yōu)化一項(xiàng)時(shí)其他參數(shù)不變。收集PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.6 單重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和鑒定 將目的基因用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化，與PGM－T載體連接，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，制備陽(yáng)性重組質(zhì)粒。

1.7 單重PCR靈敏度試驗(yàn) 將陽(yáng)性重組質(zhì)粒的濃度進(jìn)行10倍梯度稀釋，以1010、109、108、107、106、105、104、103、102、101copies／μL 作為標(biāo)準(zhǔn)品模板。取109～101copies／μL按1.5優(yōu)化出的最佳條件進(jìn)行擴(kuò)增，以驗(yàn)證本方法的靈敏度。

1.8 多重PCR反應(yīng)的優(yōu)化 在單重PCR最佳反應(yīng)條件的前提下，于一個(gè)反應(yīng)管中用4對(duì)引物同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同1.5進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化，收集PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.9 多重PCR反應(yīng)的特異性 分別對(duì)牛皰疹病毒I型等核酸進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。每次擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)，設(shè)雙蒸水作陰性對(duì)照和牛新孢子蟲(chóng)與?；蚪M混合物作陽(yáng)性對(duì)照，以檢測(cè)方法的特異性。

1.10 多重PCR共擴(kuò)增反應(yīng)的靈敏度檢測(cè) 將等量的內(nèi)標(biāo)基因與目的基因同步10倍梯度稀釋后作為模板加入反應(yīng)體系，檢測(cè)共擴(kuò)增對(duì)反應(yīng)靈敏度。

1.11 內(nèi)標(biāo)模板對(duì)多重PCR反應(yīng)靈敏度的影響固定Prolactin重組質(zhì)粒濃度為109copies／反應(yīng)不變，與各系列梯度稀釋的目的基因進(jìn)行共擴(kuò)增，驗(yàn)證高濃度內(nèi)標(biāo)基因的存在是否會(huì)影響目的基因擴(kuò)增的靈敏度。

1.12 重復(fù)性試驗(yàn) 以新孢子蟲(chóng)全基因組為模板，用優(yōu)化好的多重PCR方法進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，以驗(yàn)證其穩(wěn)定性。

1.13 臨床樣品的檢測(cè) 應(yīng)用所建立的多重PCR方法對(duì)采自新疆不同牛場(chǎng)的樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 單重PCR反應(yīng)及優(yōu)化結(jié)果 優(yōu)化后的單重PCR反應(yīng)體系為：dNTP終濃度1.5mmol／L，引物終濃度0.4μmol／L，Mg2＋終濃度1.5mmol／L，TaqDNA聚合酶終濃度1.0IU，反應(yīng)體積為25μL；擴(kuò)增條件為：95℃，5min；95℃，30s，58℃，20s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)；最后經(jīng)72℃延伸10min。擴(kuò)增出大小為156bp、201bp、231bp和256bp的電泳條帶，與目的片段相符，見(jiàn)圖1。

圖1 各引物PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 單重PCR靈敏度試驗(yàn) 用優(yōu)化后的反應(yīng)條件分別對(duì)10倍梯度稀釋的4種重組質(zhì)粒（109～101copies／μL）進(jìn)行擴(kuò)增，最低檢測(cè)限均為102copies／反應(yīng)，以NcSRS2重組質(zhì)粒的靈敏度為例，見(jiàn)圖2。

圖2 NcSRS2靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.3 多重PCR反應(yīng)及優(yōu)化結(jié)果 優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)體系為：dNTP終濃度2.0mmol／L，引物的終濃度為0.6μmol／L，Mg2＋終濃度2.0mmol／L，TaqDNA聚合酶終濃度1.25U，反應(yīng)體積為25μL；擴(kuò)增條件為：95，5min；95℃，30s，58℃，30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；最后經(jīng)72℃延伸10min。在同一反應(yīng)管中分別擴(kuò)增出大小為156bp、201bp、231bp和256 bp的電泳條帶，與目的片段相符，見(jiàn)圖3。

2.4 多重PCR特異性試驗(yàn) 應(yīng)用多重PCR方法對(duì)各核酸進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果只在prolactin與犬新孢子蟲(chóng)核酸混合物中擴(kuò)增出大小為156bp、201bp、231 bp和256bp的特異性條帶，而其他樣品均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，說(shuō)明該方法具有較強(qiáng)的特異性，見(jiàn)圖4。

2.5 多重PCR共擴(kuò)增靈敏度試驗(yàn) 將等量的4種重組質(zhì)粒按10倍梯度稀釋混合后作為模板，采用多重PCR方法進(jìn)行共擴(kuò)增，結(jié)果顯示當(dāng)質(zhì)粒濃度均為103copies／反應(yīng)時(shí)，各基因均可擴(kuò)增出目的條帶，說(shuō)明各基因間沒(méi)有產(chǎn)生明顯的抑制，見(jiàn)圖5。

2.6 內(nèi)標(biāo)對(duì)多重PCR反應(yīng)靈敏度的影響 固定Prolactin重組質(zhì)粒的濃度為109copies／反應(yīng)，分別與10倍梯度稀釋的3種目的基因的重組質(zhì)粒（109～101copies／反應(yīng)）的混合物共同作為模板，采用多重PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)各目的基因的檢測(cè)靈敏度仍為103copies／反應(yīng)，說(shuō)明內(nèi)標(biāo)基因存在對(duì)目的基因的擴(kuò)增影響較小，見(jiàn)圖6。

圖6 多重PCR檢測(cè)靈敏度

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 用所建立的多重PCR方法，以牛新孢子蟲(chóng)全基因組為模板進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，均可擴(kuò)增出特異片段，圖略。

2.8 臨床樣品檢測(cè) 利用所建立的多重PCR方法對(duì)來(lái)自新疆不同牛場(chǎng)的50份流產(chǎn)牛全血和8份流產(chǎn)胎兒樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，3份流產(chǎn)牛全血和1份流產(chǎn)胎兒樣品呈陽(yáng)性。

3 討論

NcSAG1基因是編碼新孢子蟲(chóng)主要表面抗原蛋白NcSAG1的基因，存在于速殖子中，與弓形蟲(chóng)上的同位基因同源性很低［6］；NcSRS2基因是犬新孢子蟲(chóng)一種重要功能基因，在剛地弓形蟲(chóng)基因組中不存在［7］，其編碼的NcSRS2蛋白存在于致密顆粒棒狀體內(nèi)以及速殖子表面；而重復(fù)序列Nc－5基因僅存在于犬新孢子蟲(chóng)基因組中［8］。將3個(gè)不同基因作為目的片段，只要出現(xiàn)其中任1個(gè)至3個(gè)目的條帶即可判斷為陽(yáng)性，避免了因某一種基因發(fā)生變異導(dǎo)致的單重PCR檢測(cè)出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，增加了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

研究表明，臨床樣品中含有的大量復(fù)雜未知成分和核酸抽提過(guò)程中殘留的試劑可能抑制PCR擴(kuò)增，包括提取過(guò)程中核酸的丟失，這些情況都會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。本試驗(yàn)以牛病為研究對(duì)象，故將牛性腺基因引入作為內(nèi)標(biāo)，同步參與核酸提取和反應(yīng)擴(kuò)增，可對(duì)整個(gè)檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。為了避免檢測(cè)過(guò)程中基因組DNA片段的降解，內(nèi)標(biāo)基因常選擇較短的目的序列。只有在內(nèi)標(biāo)基因正常擴(kuò)增的前提下，出現(xiàn)3個(gè)目的基因中的任何1種到3種，結(jié)果均真實(shí)可靠。若沒(méi)有任何擴(kuò)增條帶，說(shuō)明核酸可能丟失或含有PCR抑制物質(zhì)。

多重PCR的影響因子比較復(fù)雜［9］，當(dāng)在同一反應(yīng)體系中存在多對(duì)引物時(shí)，PCR的靈敏度會(huì)降低［10］，這可能與多對(duì)引物間更容易形成二聚體有關(guān)，故引物的設(shè)計(jì)是關(guān)鍵。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的每條引物之間幾乎不存在交叉反應(yīng)，且退火溫度比較相近，保證了在相同條件下目的片段都能得到有效擴(kuò)增，4種目的片段之間至少相差20bp，能夠在2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)中明顯區(qū)分。多重PCR各引物間的相對(duì)濃度也會(huì)影響擴(kuò)增效果，很多研究都對(duì)此進(jìn)行了優(yōu)化［11］。但實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，樣品里各模板含量是未知的，即如果某種模板含量高，則擴(kuò)增條帶相對(duì)較亮，反之則較弱，調(diào)整引物間相對(duì)終濃度對(duì)于臨床檢測(cè)意義不大。更重要的是，如果固定了每對(duì)引物間的相對(duì)終濃度，那么每當(dāng)有新的引物加入時(shí)都要重新對(duì)其進(jìn)行大量的優(yōu)化。本試驗(yàn)把所有引物看成一個(gè)整體，通過(guò)將退火時(shí)間延長(zhǎng)至30s、延伸時(shí)間延長(zhǎng)至1min，并對(duì) Mg2＋濃度、dNTP濃度等在單重PCR基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，最終在每對(duì)引物按等濃度加入時(shí)，各目的基因均能達(dá)到一致的擴(kuò)增效果，且操作更為簡(jiǎn)便，這可能與延長(zhǎng)退火時(shí)間可以增加引物與模板結(jié)合的機(jī)會(huì)有關(guān)?？紤]到臨床應(yīng)用中，牛性腺基因存在的穩(wěn)定性和被檢目的基因的不確定性，本試驗(yàn)將較高濃度的內(nèi)標(biāo)基因與系列稀釋的目的基因進(jìn)行共擴(kuò)增，未見(jiàn)對(duì)靈敏度產(chǎn)生明顯影響。

本試驗(yàn)所建立的牛新孢子蟲(chóng)病多重PCR檢測(cè)方法的靈敏度與單重PCR相比，只低了10倍，且具有較好的特異性和可重復(fù)性，既能對(duì)反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行質(zhì)量控制，又能達(dá)到快速、準(zhǔn)確檢測(cè)的目的。

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