重慶地區(qū)雛鵝暴發(fā)鴨病毒性肝炎

唐 妤，甘艷君，陳思懷，何洪章，郎靜宇，李繼祥

（1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌402460；2.重慶永健生物技術(shù)有限公司，重慶 榮昌402460）

鴨病毒性肝炎（duck virus hepatitis，DVH）是一種傳播迅速并對(duì)雛鴨具有高度致死性病毒病，以肝炎為主要特征。本病可由3種不同類型的鴨肝炎病毒（duck hepatitis virus，DHV）引起，即DHV－1、DHV－2和 DHV－3［1］。依據(jù)3D 基因（RNA 依賴性RNA聚合酶，RdRp）的核苷酸序列，DHV－2和DHV－3現(xiàn)已被歸為星狀病毒科（Astroviridae）的成員［2］，但在臺(tái)灣和韓國發(fā)現(xiàn)新型 DHV（new duck hepatitis virus，NDHV）。NDHV與DHV－1有相似的基因組結(jié)構(gòu)、VP1基因的核苷酸和氨基酸序列相似性分別在71%和77%以下，無抗原相關(guān)性［4］。臺(tái)灣和韓國NDHV在核苷酸和氨基酸水平上的相似性分別為71%～72%和77%～78%［4］。DHV－1、臺(tái)灣NDHV和韓國NDHV分別被命名為DHVA、DHV－B和 DHV－C，其中 DHV－B僅臺(tái)灣有病例報(bào)告，DHV－C目前僅發(fā)生于中國大陸與韓國［5］。2010年12月，重慶地區(qū)某些養(yǎng)鵝場的雛鵝疑似暴發(fā)鴨病毒性肝炎，經(jīng)RT－PCR檢測鴨肝炎病毒VP1基因、病毒分離鑒定及動(dòng)物試驗(yàn)確診為雛鵝暴發(fā)鴨病毒性肝炎。

1 材料與方法

1.1 臨床診斷 2010年12月，重慶地區(qū)某些養(yǎng)鵝場的3～14日齡雛鵝疑似暴發(fā)鴨病毒性肝炎，發(fā)病率20%～30%，死亡率在20%～25%。病鵝表現(xiàn)為蹲伏，嗜睡，側(cè)臥，兩腿痙攣性后踢，頭向后背呈現(xiàn)角弓反張，在出現(xiàn)癥狀后1～2h內(nèi)死亡。死亡鵝的主要病變?cè)诟闻K，表現(xiàn)為腫大、有點(diǎn)狀或瘀斑狀出血。抗生素治療無效，抗DHV－A和DHV－C二價(jià)抗體緊急預(yù)防注射能顯著降低發(fā)病率和死亡率。

1.2 病料采集與處理 采集具有典型臨床癥狀和病理變化的5日齡病死鵝肝臟，剪碎后按組織重量1∶4（W／V）加入滅菌生理鹽水，高速勻漿制成肝組織乳劑，于－40℃反復(fù)凍融3次；加入氯仿（終濃度為5%），室溫下振蕩15min；5 000r／min（4℃）離心15min；上清液經(jīng)微孔濾膜過濾除菌后備用。

1.3 病毒分離與純化 將肝組織處理液用含雙抗（青霉素、鏈霉素各300IU（μg）／mL）的生理鹽水10倍稀釋，經(jīng)尿囊腔接種10日齡易感鴨胚（重慶永健生物技術(shù)有限公司提供），每胚0.2mL，37℃培養(yǎng)7 d，記錄死胚情況。收集48～96h死亡鴨胚的尿囊液，經(jīng)無菌和支原體檢驗(yàn)合格后作為鴨胚毒，－40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

鴨胚毒用含雙抗的生理鹽水100倍稀釋，與鴨肝炎病毒抗血清［抗鴨肝炎病毒Ⅰ型血清（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所范書才研究員惠贈(zèng)），中和效價(jià)1∶775，批號(hào)：080613；抗鴨肝炎病毒韓國變異型LS株血清，自制，中和效價(jià)1∶617］，按25∶1（V／V）混合，37℃作用1h；接種10日齡鴨胚，每胚0.2mL；37℃培養(yǎng)7d；收集48～168h死亡鴨胚的尿囊液。經(jīng)無菌和無支原體檢驗(yàn)合格后的尿囊液按上述方法再用抗血清中和1次，收集48h～96h死亡鴨胚的尿囊液即為分離病毒。

1.4 鴨胚中和試驗(yàn) 將鴨肝炎病毒抗血清5倍遞進(jìn)稀釋后與200ELD50／0.2mL的病毒液等體積混合，37℃作用1h；經(jīng)尿囊腔接種10日齡鴨胚，每胚0.2mL；37℃培養(yǎng)，每天照蛋2次，連續(xù)觀察7d。試驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照和陰性血清對(duì)照。鴨胚在37℃孵育觀察168h。

1.5 動(dòng)物試驗(yàn) 6～7日齡健康四川白鵝（重慶永健生物技術(shù)有限公司提供）用于動(dòng)物試驗(yàn)，每只鵝頸部皮下接種1 000ELD50／0.5mL的病毒液，共接種15只。試驗(yàn)設(shè)臨床病死鵝肝組織處理液對(duì)照（0.5 mL／只）和生理鹽水對(duì)照。各組動(dòng)物隔離飼養(yǎng)，連續(xù)觀察7d，記錄發(fā)病和死亡情況。剖檢死亡鴨，觀察病理變化，并采集肝組織用于DHV VP1基因檢測。

1.6 病毒RNA的提取 按Trizol說明書操作從肝組織處理上清液和鴨胚尿囊液中提取病毒RNA。

1.7 RT－PCR 及測序 擴(kuò)增 DHV－A 和 DHV－C VP1基因的引物按文獻(xiàn)［6］報(bào)道的序列合成；擴(kuò)增DHV－B VP1基因的引物以04G株序列設(shè)計(jì)，上游引物為B－F：GGGGACACTAACCAGCTTGGTG，下游引物為 B－R：GATGGAGCTCAAACGCCAGGG，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。RTPCR按試劑盒（TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0）的使用說明進(jìn)行，其PCR條件為：94℃預(yù)變性2 min，在94℃30s、54℃30s、72℃1min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后在72℃5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，切膠，用膠回收試劑盒（TaKaRa公司產(chǎn)品）回收DNA。純化的PCR產(chǎn)物與pMD18－T載體進(jìn)行TA克隆后測序（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）。

1.8 序列分析 將測序結(jié)果用DNAStar的MegAlign程序與GenBank中登錄的DHV VP1基因參考序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析。

2 結(jié)果

2.1 病料中鴨肝炎病毒VP1檢測及序列分析 利用RT－PCR從病死鵝肝組織處理液中同時(shí)檢測到DHV－A和DHV－C病毒的VP1基因，其分別與鴨肝炎病毒C80株（DHV－A型）和C－YCZ株（DHV－C型）的參考序列相似性最高，分別為98.3%和98.7%；DHV－B病毒VP1基因檢測為陰性。

2.2 鴨肝炎病毒的分離鑒定 病死鵝肝組織處理液能在48～96h內(nèi)100%（9／9）致死鴨胚，收集的尿囊液（鴨胚毒）經(jīng)鴨肝炎病毒抗血清中和2次后獲得CQ1和CQ2毒株。CQ1和CQ2株病毒經(jīng)RTPCR分別檢測到DHV－A和DHV－C型病毒的VP1基因，其與病料中檢測到的相應(yīng)VP1基因的核苷酸序列相似性100%。CQ1株和CQ2株病毒VP1基因與16株鴨肝炎病毒VP1基因的進(jìn)化樹分析結(jié)果見圖1。在鴨胚中和試驗(yàn)中，CQ1株能被抗鴨肝炎病毒Ⅰ型（DHV－A型）血清中和，不被抗鴨肝炎病毒LS株（DHV－C型）血清中和；而CQ2株能被抗鴨肝炎病毒LS株血清中和，不被抗鴨肝炎病毒Ⅰ型血清中和。

2.3 病例復(fù)制 6～7日齡試驗(yàn)鵝接種臨床病死鵝鵝肝組織處理液、CQ1株和CQ2株病毒后分別在19h、24h和22h開始發(fā)病，表現(xiàn)出蹲伏，嗜睡及臨死前的角弓反張，死亡率分別為93%、67%和80%。死亡鵝的病理變化主要在肝臟，表現(xiàn)為輕微腫大和出血。接種肝組織處理液的病死鵝肝臟中能檢測到DHV－A和DHV－C型病毒的 VP1基因，而接種CQ1和CQ2株病毒死亡鵝分別檢測到DHV－A和DHV－C型病毒的VP1基因。

3 討論

自1949年Levine和Fabricant報(bào)道美國長島的鴨病毒性肝炎病例以來，鴨肝炎病毒在許多國家和地區(qū)相繼分離出來。近年來，鴨病毒性肝炎的流行病學(xué)特征及鴨肝炎病毒的基因型等發(fā)生了一定的改變，在我國大陸及臺(tái)灣有用弱毒疫苗免疫鴨群仍發(fā)生典型鴨肝炎的報(bào)道［7－8］，從臺(tái)灣和韓國病死鴨中分別分離 DHV－B 型和 DHV－C 型病毒［3－4］。本文利用RT－PCR從疑似暴發(fā)鴨病毒性肝炎的同一份病死鵝肝組織中檢測到DHV－A和DHV－C型病毒的VP1基因，用鴨胚分離純化到鴨肝炎病毒CQ1株（DHV－A 型）和 CQ2株（DHV－C型），及 CQ1株和CQ2株病毒人工接種雛鵝均能復(fù)制出與臨床病例相似的病例。由此可確診，重慶2010年12月某些鵝場雛鵝暴發(fā)的疾病由DHV－A型和DHV－C型病毒混合感染所致。

圖1 CQ1株和CQ2株病毒與16株鴨肝炎病毒的進(jìn)化樹

鴨肝炎自然病例僅發(fā)生于雛鴨，成年種鴨即使在污染的圈舍中也無臨床癥狀，產(chǎn)蛋正常［1］。本文確診鴨肝炎病毒可自然感染雛鵝發(fā)病，其臨床癥狀與病理變化與雛鴨感染后的表現(xiàn)一致，也可導(dǎo)致高發(fā)病率和死亡率，給養(yǎng)鵝業(yè)帶來重要啟示。在雛鵝養(yǎng)殖過程，除加強(qiáng)小鵝瘟等疾病的防控外，鴨肝炎病毒感染的危害也不容忽視。在重慶地區(qū)有鴨和鵝混養(yǎng)的習(xí)慣，尤其是在育雛階段。本次從病死鵝分離DHV病毒的VP1基因分析發(fā)現(xiàn)，與鴨源病毒間的相似性高。由此推測，雛鵝暴發(fā)的鴨病毒性肝炎是由混養(yǎng)的患病或帶毒鴨傳染導(dǎo)致的。

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