產蛋下降鴨群強毒新城疫病毒的分離鑒定與分子特征

胡北俠，王 艷，楊少華，許傳田，黃艷艷，張秀美

（1.山東省農業科學院畜牧獸醫研究所 山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東 濟南250100；2.六和飼料股份有限公司動保中心，山東 青島266109）

新城疫是嚴重危害我國和世界養禽業的主要病毒性傳染病之一，病原是新城疫病毒（NDV）。NDV屬于單股負鏈、不分節段RNA病毒，基因組長度約為15.2kb，包括3′－NP－P－M－F－HN－L－5′六個基因，分別編碼6種主要結構蛋白［1］。NDV只有一個血清型，但是可以分為不同的基因型。最近研究發現，根據病毒基因組長度、F基因和L基因序列，NDV可分為兩大分支：ClassⅠ和ClassⅡ［2］。ClassⅠNDV主要包括水禽和活禽市場分離株，而ClassⅡNDV可以分為基因Ⅰ～Ⅸ型，包括家禽、寵物鳥以及野鳥分離株［3－4］，研究表明，基因Ⅶ是我國目前NDV流行株的優勢基因型。

流行病學研究證明，水禽是NDV的天然貯存宿主［3］。自1997年以來，國內不斷有水禽感染NDV發病的報道［5］，似乎表明NDV的流行病學已經發生新的變化。自2008年11月至2009年2月，本實驗室從發生產蛋下降的兩個肉種鴨群中分離了兩株NDV強毒，并對其F基因和HN基因進行了序列分析和同源性比較，進一步豐富了NDV的分子流行病學信息。

1 材料與方法

1.1 SPF雞、雞胚、菌種、質粒和試劑 SPF雞、雞胚由山東家禽所SPF雞研究中心提供。工程菌DH5a由本實驗室保存。RNA抽提試劑、DNA回收、PCR試劑盒等，均購自TaKaRa公司。

1.2 病毒分離鑒定 取病鴨氣管、肝臟和輸卵管等組織研磨、無菌處理后接種10～11日齡SPF胚。用ND，禽流感（H5、H9）陽性血清和NDV單抗對分離毒進行鑒定。參考文獻［1］方法進行雞胚平均死亡時間（MDT）和1日齡雛雞腦內致病指數（ICPI）的測定。

1.3 引物、病毒RNA提取及RT－PCR 擴增F和HN基因的引物序列參考文獻［6］。

病毒RNA的提取、反轉錄按試劑盒說明書進行。PCR均采用50μL反應體系，擴增產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.4 目的基因的克隆與序列測定 將各PCR產物通過凝膠電泳回收各目的條帶進行抽提、純化后與pMD18－T vector進行連接、轉化和藍／白斑篩選，挑取白色菌落接種于LB培養基中擴增培養，提取其質粒，并進行PCR鑒定。經PCR鑒定為陽性的重組質粒，送北京華大基因研究中心測序。

1.5 F基因（374bp）分型與同源性比較 參考文獻［3－5］等基因分型方法，利用DNAStar 7.0（MegAlign）軟件對NDV分離株和參考株進行F基因分型，繪制系統進化樹。分別對鴨NDV分離株和參考毒株的F基因和HN基因全長同源性進行分析比較。

2 結果

2.1 病毒分離鑒定 兩份鴨病料接種SPF雞胚后于48～84h致死雞胚，尿囊液HA效價為28和27，HI試驗中與NDV陽性血清、NDV單抗反應陽性，與AIV（H5、H9）陽性血清反應均為陰性，初步確定為 NDV，分別命名為Duck／China／SD6／2008 和Duck／China／SD7／2009，其 MDT 分別為77.6h，ICPI為2.0，符合強毒NDV的特征。

2.2 病毒F、HN基因RT－PCR和序列測定結果F、HN基因均擴增出了目的片段（圖略）。經測序后，F基因開放閱讀框架（ORF）全長1 662bp，編碼553個氨基酸，第112～117位氨基酸序列為112－RRQKRF－117，符合強毒NDV F蛋白裂解位點的分子特征。HN基因ORF全長1716bp，編碼571個氨基酸。

2.3 F基因（1－374bp）基因分型與同源性比較從圖1可以看出，2個鴨NDV分離株屬于NDV ClassⅡ分支，與國內近年來分離的基因ⅦNDV遺傳距離較近，而與健康鴨群NDV分離株Duck／China／58／2008［7］遺傳距離較遠。

圖1 根據NDV F基因高變區（374bp）繪制的遺傳進化樹

F和HN基因全長同源性分析發現，2個鴨NDV分離株與與基因ⅦNDV分離株同源性較高，分別為94.1%～99.7%和94.4%～97.1%，與同期分離的雞源NDV強毒株Chicken／China／SD4／2008（HM748947）同源性最高，分別為99.3%～99.5%和99.5%～99.7%，而與健康鴨群 NDV分離株Duck／China／58／2008（ClassⅠ分支）同源性為65.1%～65.3%和72.3%～72.6%。兩個鴨分離株 Duck／China／SD6／2008和 Duck／China／SD7／2009F基因和HN基因全長同源性分別為99.8%和99.5%。

3 分析與討論

隨著臨床上鴨群感染NDV發病的不斷出現，山東省部分蛋鴨或種鴨群已進行ND疫苗的免疫，本研究的發病鴨群也已進行ND免疫，發生產蛋下降前NDHI抗體滴度分別為6.3log2～7.4log2和9.4log2～12log2，鴨群主要表現采食量下降，死淘率正常，產蛋下降15%～30%，畸形蛋增加。從發生產蛋下降到恢復正常一般需要2～4周，新城疫HI抗體滴度并沒有明顯的升高（另文報道），而雞群感染NDV發生產蛋下降前后HI抗體滴度一般會升高2log2左右，具體原因尚有待進一步研究。

建立在NDV F基因高變區（374bp）的系統進化和基因分型方法已被證明是NDV分類的最有效方法，廣泛用于NDV的分子流行病學研究。基因分型結果表明，2個鴨NDV分離株屬于基因Ⅶ，與國內近年來分離的基因ⅦNDV遺傳距離很近，特別是與本實驗室同期分離的山東省雞源NDV強毒株（Chicken／China／SD4／2008）遺傳距離最近，而與本實驗室從健康鴨群分離的ClassⅠ NDV（Duck／China／58／2008）明顯不同。F基因和HN基因全長序列分析結果表明，2個鴨NDV分離株與同期雞源NDV 分離株 Chicken／China／SD4／2008 核苷酸同源性分別為99.3%～99.5%和99.5%～99.7%，與健康鴨群NDV分離株Duck／China／58／2008同源性為65.1%～65.3%和72.3%～72.6%，表明2個鴨NDV分離株可能來源于雞群，而與從健康鴨群分離的NDV弱毒株無關。

［1］殷震，劉景華.動物病毒學［M］.2版.北京：科學出版社，1997：743－748.

［2］Alíz Czeglédi，Dorina Ujvári，Eszter Somogyi，etal.Third genome size category of avian paramyxovirus serotype 1（Newcastle disease virus）and evolutionary implications［J］.Virus Research，2006，120：36－48.

［3］L Mia Kim，Daniel J King，Phillip E Curry，etal.Phylogenetic Diversity among Low－Virulence Newcastle Disease Viruses from Waterfowl and Shorebirds and Comprarion of Genotype Distributions to Those of Poultry－Origin Isolates［J］.Journal of Virology，2007，12：12641－12653.

［4］L Mia Kim，Daniel J King，David L Suarez，etal.Characterization of ClassⅠNewcastle Disease Virus Isolates from Hong Kong Live Bird Markets and Detection Using Real－Time Reverse Transcription－PCR［J］.Journal of Clinical Microbiology，2007，4：1310－1314.

［5］劉秀梵.家養水禽A型流感和新城疫病毒的感染和臨床疾病［C］.第15屆世界禽病大會（中國畜牧獸醫學會2007年學術年會）論文集，2007：87－95.

［6］胡北俠，黃艷艷，姜寧朋，等.蛋雞輸卵管積液中新城疫強毒的分離鑒定與分子特征［J］.中國獸醫雜志，2009，45（4）：9－12.

［7］Hu B，Huang Y，Zhang X，etal.Avian influenza virus and Newcastle disease virus（NDV）surveillance in commercial breeding farm in China and the characterization of ClassⅠNDV isolates［J］.Vet Microbiol，2010，144（1－2）：82－86.