山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的表達與細胞凋亡的相關性

關會敏，冉雪琴，姬志林，王嘉福，3

（1.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽550025；2.楚雄醫藥高等?？茖W校醫學檢驗系，云南 楚雄675000；3.貴州大學農業生物工程省重點實驗室，貴州 貴陽550025）

山羊痘病毒（goat pox virus，GPV）為DNA病毒，屬痘病毒科（Poxviridae）、脊索動物痘病毒亞科（Chordopoxrinae）、羊痘病毒屬（Capripoxvirus），是引起山羊痘的直接病原，羔羊易感，接觸感染率可達100%。山羊痘為急性、熱性傳染病，臨床癥狀以皮膚、呼吸道及消化道等黏膜處出現痘疹為主［1］，發病率和死亡率均較高，嚴重影響了山羊養殖業的發展。痘病毒是惟一可以在感染細胞的胞質中獨立復制的病毒［1］。在痘病毒侵入宿主細胞的初期，需在活細胞內完成病毒粒子的復制和組裝等過程，因此病毒進化出特殊的機制在感染的早期，阻礙宿主細胞過快地發生細胞凋亡或死亡。多數痘病毒家族可產生抗細胞凋亡因子，目前已知的痘病毒抗凋亡蛋白主要有：牛痘病毒編碼的CrmA蛋白，人傳染性軟疣病毒蛋白 MC159／160，黏液瘤病毒編碼的M11L蛋白。但GPV是否產生抗凋亡蛋白還不清楚。本文著重研究GPV編碼的抗凋亡蛋白基因結構及其致病機制。

1 材料與試劑

1.1 材料 山羊痘病毒株（LD株）由貴州大學動物科學學院分離［2］，Vero細胞，購自中國典型培養物保藏中心，大腸桿菌DH5α和載體pBluscript.SK由本實驗室保藏。

1.2 試劑 RM1640／M199干粉為Gibco公司產品，胎牛血清由HyClone公司生產，PCR相關試劑，購自天根生化科技（北京）有限公司，RNA fast200總RNA極速抽提試劑盒，購自上海飛捷生物公司，引物和堿基序列的測定由上海捷瑞生物科技有限公司完成。

2 方法

2.1 細胞及病毒的培養 Vero細胞接種于含10%胎牛血清的RM1640培養基中37℃培養成單層。接毒GPV（MOI＝50），吸附1～1.5h，加入含2%胎牛血清的RM1640培養基，37℃培養，當70%～80%細胞脫落時，胰蛋白酶消化收集細胞，反復凍融，4 000 r／min離心20min，取上清－20℃保存備用。

2.2 細胞病變及凋亡檢測 取GPV感染0、12、18、24、36、48h的 Vero細胞，觀察細胞的形態變化；0.4%臺盼藍染色，計數死亡細胞數并計算細胞的死亡率（死細胞／總細胞數×100%）；吖啶橙（AO）／溴乙錠（EB）混合染色［3］，計數細胞凋亡數并計算細胞的凋亡率（凋亡細胞／總細胞數×100%）。

2.3 病毒基因組的提?。?］病毒液經SDS和蛋白酶K，56℃水浴消化1h，加入等體積的酚－氯仿－異戊醇（25∶24∶1）溶液抽提，離心，取上清，3mol／L醋酸鈉（pH 值5.2）和無水乙醇，－20℃沉淀30 min，于4℃ 12 000r／min離心15min，取沉淀用70%乙醇洗滌2次，離心，自然干燥，溶于TE溶液。2.4 基因的擴增及克隆

2.4.1 引物設計 據已知序列設計P1／P2、P3／P4兩對特異性引物，其中P1／P2用于山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的克隆，P3／P4用于基因表達的檢測。引物堿基序列為：P1：5′－GTGCTCTTCCAACATGGATAACTATAACTACAACA－TAG－3′，P2：5′－CCTCTGCAGTTACTTCCATCGTA TCCTACC－3′，下劃線部分為SapⅠ和PstⅠ酶切位點；P3：5′－GAATGTGTACTTGCGAGACT－3′，P4：5′－CTTCC ATCGTATCCTACCAAT－3′，另設計一對引物P5／P6，分析β－actin基因的表達量作為內參照，P5：5′－GGCTACA GCTTCACCACCAC－3′，P6：5′－TACTCCTGCTT GCTGATCCAC－3′。

2.4.2 基因的擴增及克隆 以1μg山羊痘病毒基因組DNA為模板，P1／P2為引物，擴增山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因，擴增條件：94℃變性8min；94℃40s，55℃30s，72℃30s，30個循環；72℃ 5min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，染色，觀察，回收目的片段，SapⅠ和PstⅠ雙酶切，與pBluscript.SK質粒連接，轉化感受態細胞DH5α，涂布LB平板（含氨芐西林），37℃培養過夜，挑取陽性克隆。經質粒大小、菌落PCR和質粒PCR鑒定為陽性的重組子測定堿基序列。

2.5 GPV抗凋亡蛋白基因的RT－PCR分析 提取細胞和病毒總RNA，經甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，合格樣本經反轉錄，以引物P3／P4擴增山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因片段，同期以引物P5／P6檢測β－actin基因的表達量為內參。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，Gene tools軟件（Gene co.）分析基因的相對表達量。

3 結果

3.1 細胞凋亡率及死亡率 與對照組（圖1A）相比，GPV感染Vero細胞24h之前，細胞的形態沒有明顯的變化，24h之后出現明顯的形態學改變：細胞變圓，聚集成堆、拉絲、脫落（圖1B），48h時，細胞大量脫落、裂解。臺盼藍染色結果顯示，隨著病毒感染時間的延長，Vero細胞的死亡率逐漸增加：36h約為80%，48h接近100%（圖2）。經AO／EB染色，隨機計數200個細胞，計算細胞的凋亡率。與對照組相比，至24h時沒有明顯的細胞凋亡，36h時檢測到凋亡細胞，以早期凋亡為主，48h細胞凋亡率明顯增加至13%，且以晚期凋亡為主，同時壞死細胞也隨之快速遞增，達到87%（圖3）。

3.2 山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的克隆 以P1／P2為引物PCR擴增，獲得1條約530bp的條帶（圖4，5），經克隆測序（圖6），證實重組子中含有插入片段531bp，經NCBI核酸庫在線比對，確認本文克隆到的531bp DNA片段確為山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因（goat pox virus antiapoptosis protein），命名為GGPVAP基因，作為一個獨立的基因登錄到Gen－Bank上（EF536858）。

圖5 重組質粒的酶切鑒定

在GGPVAP序列中，（A＋T）對的含量為77.97%，基因編碼完整的抗凋亡蛋白，由176個氨基酸組成，分子量20.76kD，等電點（PI）7.58。經NCBI蛋白庫在線分析，與GTPV＿gp014相似性100%，與LSDV017相似性為96%，與SPPV－14的相似性為95%，均屬于抗凋亡膜蛋白PHA02855超家族，具有固定的結構域，且與M11L蛋白家族固定結構域類似。

以DSA軟件（www.expasy.org）進行在線分析，GGPVAP蛋白的C端有一顯著跨膜域，含有22個氨基酸，位于146～167位氨基酸區段，而M11L蛋白的C端也有類似的跨膜域，且均是由外向內。在跨膜域內，154、155、158三個位點的氨基酸高度保守，分別是纈氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸，均為疏水性氨基酸，推測其在跨膜結構中起著重要的作用。

3.3 GGPVAP基因的表達變化 以提取細胞和病毒總RNA為模板，以β－actin為內參照，經RT－PCR對GGPVAP基因的表達量進行分析，結果顯示，隨著感染時間的延長，GGPVAP基因的表達量逐漸上升，至24h時達到最大（P＜0.05），之后轉而下降，36h時降到12h時的水平（P＞0.05）（圖7）。

4 討論

以本地分離的山羊痘病毒（GPV）感染敏感的Vero細胞，至24h時之前未檢測到Vero細胞的凋亡，GPV作用48h時才檢測到Vero細胞凋亡，凋亡率13%，同時以臺盼藍染色檢測到Vero細胞的大量壞死。大腸桿菌志賀樣毒素Stx2（2μg／mL）作用Vero細胞24h細胞的凋亡率就達到了90%［5］。相比之下，山羊痘病毒感染Vero細胞的凋亡率明顯偏低，提示本地分離的山羊痘病毒作用于Vero細胞后凋亡發生的時間被推遲。進一步研究GPV感染Vero細胞過程中GGPVAP基因的表達量變化，結果顯示，GGPVAP基因的表達量24h時出現峰值，之后轉而下降，與Vero細胞凋亡率的變化呈反變關系。

圖7 GGPVAP基因的表達變化

牛痘病毒編碼的CrmA蛋白是抗凋亡蛋白因子之一，可直接作用于IL－1β轉化酶，抑制caspase的活化，阻斷細胞凋亡的信號傳遞，抑制細胞凋亡［6］；人傳染性軟疣病毒的 MC159／160蛋白，阻止caspase 8的活化，阻斷Fas和TNFR1介導的細胞凋亡［7］；黏液瘤病毒編碼的 M11L蛋白定位于線粒體膜上，通過與Bak和Bax作用阻止線粒體凋亡途徑的發生［8］。從貴州山羊痘病毒基因組中分離出山羊痘病毒的抗凋亡蛋白，與同屬病毒凋亡蛋白的相似性95%～100%，M11L家族蛋白相似性為31%～36%，由此明確克隆到的基因GGPVAP確為山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因。同時，GGPVAP蛋白的C－端含有與痘病毒家族抗凋亡蛋白類似的跨膜域，提示該跨膜域可能作為細胞內膜性受體或離子通道，抑制細胞凋亡信號的傳導，起到延緩或抑制Vero細胞凋亡的作用。細胞凋亡是宿主細胞對病毒感染的主動防御機制之一，是免疫監控的一部分。被感染的細胞以凋亡方式阻止病毒繁殖，保護其他的組織細胞免遭病毒的侵害。GPV一旦進入宿主山羊的體內，就能迅速增殖，動物之間的傳染率高、發病率也較高。由此推測GPV侵入后，表達的山羊痘病毒抗凋亡蛋白可以有效阻止宿主細胞的凋亡進程，至24h（可改為“至24h”），病毒已基本完成了病毒粒子的復制及其裝配過程［1］，結合本文的檢測結果，24h后山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的表達量下降，宿主細胞的凋亡或壞死得以發生，此時細胞發生的壞死導致的破裂則有助于病毒的釋放，進一步侵染其他的細胞。

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