高壓處理對大米蛋白溶解性及其分子特征的影響

王章存 崔勝文 田衛環 趙學偉 鄭堅強 李昌文 袁道強

高壓處理對大米蛋白溶解性及其分子特征的影響

王章存 崔勝文 田衛環 趙學偉 鄭堅強 李昌文 袁道強

(鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，鄭州 450002)

研究了pH 8．0和pH 10．0條件下500 MPa高壓處理對熱變性大米蛋白溶解性的影響，并用Sephadex G－100色譜和SDS－PAGE分析了其分子特征的變化，用掃描電鏡觀察了大米蛋白的表觀特征。結果顯示，pH 8．0時500 MPa處理可使大米蛋白的溶解性由12．03%提高到19．15%，pH 10．0時高壓處理則可由16．60%提高到24．87%。高壓處理后的大米蛋白顆粒表面疏松，可使較大的蛋白質分子溶出，也產生了更小的蛋白質分子，且高壓與非高壓時溶出的蛋白質組分具有不同的紫外吸收特征。高壓處理后的可溶性蛋白中均含有14、35 ku和少量22 ku亞基，非可溶性部分中除上述亞基外，還含有12、16、110 ku亞基。表明不同高壓處理影響大米蛋白的溶解性能和分子特征，但對亞基的影響不明顯。

大米蛋白 高壓 溶解性 分子特征

以大米為原料的淀粉糖和發酵工業生產中有大量的副產品大米蛋白，因其加工過程經歷了90℃以上的高溫，蛋白質發生嚴重的熱變性而難溶于水，很難在食品工業中應用。國內有很多關于提高這種熱變性大米蛋白溶解性的研究報道，主要用強堿溶液或酶解技術，但其溶解性能一直未能很好解決［1－4］。強堿法溶解大米蛋白顯然不適用于食品工業，而酶解過程中即使增加酶用量或延長酶解時間等也只能使約60%的蛋白質溶解，這與其他蛋白質的酶解有很大不同。目前文獻中只有少量關于熱變性米蛋白分子結構特征的報道［5－7］，一個重要原因是該蛋白難以溶解，常規的技術手段和方法無法有效應用，所以大米蛋白不溶解甚至抵抗酶解的原因至今尚不清楚。

大量研究表明，高壓處理可以改變蛋白質顆粒的聚集狀態和高級結構，影響蛋白質中—S—S—的存在狀態，從而影響蛋白質的功能性質和蛋白質的酶解模式例如，用200 MPa處理脫脂乳可導致β－乳球蛋白(β－Lg)形成以—S—S—連接的二聚體，800 MPa處理又使β－Lg亞基分離，而此時其他小分子乳清球蛋白卻發生聚集［8］。β－Lg經過200 MPa高壓處理后就可以被胃蛋白酶水解［9］，經400 MPa處理后酶解10 min就不存在完整的 β －Lg分子［10］，經600 MPa處理后酶解1 min即可被水解成1 500 u以下的小分子［11］。Kieffer等［12］發現200 MPa處理小麥面筋蛋白可降低其面筋強度，增加游離—SH的含量;若進一步增加壓力可導致面筋蛋白質分子內部發生—S—S—的斷裂和重排。可見，高壓處理對蛋白質的影響效果與壓力大小、保壓時間、溫度、蛋白質種類甚至溶劑條件等因素有關。

本試驗研究不同pH條件下高壓處理對大米蛋白溶解性及某些分子特征的影響，為進一步改善大米蛋白溶解性的技術方法提供依據。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

大米蛋白:以荊州漢科生物公司生產淀粉糖中的副產品為原料，按文獻［13］方法經水洗脫糖后所得。凱式定氮法測定CP=75．02%。

Sephadex G－100:瑞典Pharmacia公司;N，N，N'，N'－四甲基乙二胺(TEMED):FLUKA公司;考馬斯亮蘭R250:FLUKA公司;丙烯酰胺(Acr)，N，N'－亞甲基雙丙烯酰胺(Bis):Amresco公司;低分子質量標準蛋白(Mr．14 400～97 400):大連寶生物有限公司。

1．2 儀器與設備

UHP900×2－Z超高壓處理裝置:包頭文天科技公司;UV－8100 B紫外可見分光光度計:北京Lab－Tech儀器公司;BSZ－100自動部份收集儀和HL－2恒流泵:上海滬西分析儀器廠;DYY－7C電泳儀和DYCZ－24DN電泳槽:北京六一儀器廠;JSM－6490LV掃描電子顯微鏡:日本電子公司。

1．3 試驗方法

1．3．1 樣品的超高壓處理

準確稱取大米蛋白5．0 g分別懸浮于100 mL的pH 8．0，pH 10．0水溶液中。將上述蛋白樣品溶液于兩層聚乙烯塑料袋(8 cm×10 cm)中真空密封(不留頂隙)，置于壓力容器內腔，浸沒于加壓介質中，于25℃下設定壓力500 MPa，高壓處理30 min。升壓、降壓均在1 min內完成。樣品經高壓處理后1 000 r/min離心10 min，分析可溶物和不溶物組分的相關指標。

1．3．2 蛋白質的溶解性

利用雙縮脲法測定可溶性蛋白的含量。以可溶部分蛋白與原料蛋白含量比值表示。

1．3．3 SDS－PAGE分析

采用Laemmli電泳系統［14］，分離膠質量分數為15%和濃縮膠質量分數為4%。可溶部分和不溶部分蛋白經還原性樣品緩沖液(含巰基乙醇和SDS)處理。不溶部分利用0．01 mol/L NaOH預處理。電泳結束后，用考馬斯亮藍R－250染色。

1．3．4 Sephadex G－100色譜分析

將離心上清液用0．45μm微孔濾膜過濾上樣。色譜柱1．2 cm×100 cm，進樣量為2．5 mL。洗脫液為0．9%的生理鹽水，流速為20 mL/h，以每管2．5 mL收集，用紫外檢測器280 nm檢測蛋白質含量，并繪制洗脫曲線。

1．3．5 掃描電鏡分析(SEM)

將沉淀部分冷凍干燥。取適量干燥后樣品，分散在貼有雙面膠的SEM的樣品臺上，通過離子濺射在樣品上噴金后，用掃描電子顯微鏡觀察形態結構［15］。掃描電鏡工作條件:高壓10 kV，束流5×10－9mA，工作距離15 mm。

1．3．6 數據處理

試驗數據均進行3次重復試驗，利用SPSS17．0軟件進行方差分析和Duckey分析(95%置信區間)。

2 結果與討論

2．1 高壓對蛋白溶解性的影響

研究了pH 8．0和pH 10．0兩種pH條件下500 MPa高壓處理對大米蛋白溶解性的影響，并以未高壓處理為對照，測定結果(表1)顯示，在相同壓力條件下，大米蛋白在pH 10．0時的溶解性高于pH 8．0，而相同pH時，500 MPa高壓處理使大米蛋白的溶解性增加更顯著，這可能是高壓改變了蛋白質的分子結構或者某些類型共價鍵(如－S－S－)的存在狀態，從而改善蛋白質的溶解性。

進一步對－SH含量的測定發現，以單位質量的蛋白質為基數，不同處理樣品的可溶性蛋白－SH含量差別不大，說明－SH狀態可能是影響大米蛋白溶解性的必要條件。

表1 不同pH和壓力下蛋白的溶解性/%

2．2 可溶性組分的凝膠色譜分析

利用Sephadex G－100凝膠色譜對pH 8．0時500 MPa高壓和非高壓(即0．1 MPa常壓)處理樣品的可溶性組分進行了分析(圖1)，可以看出，常壓時可溶性組分出現2個峰(峰1和2)，保留時間分別為80 min和215 min，而高壓處理樣品分離出3個峰(峰Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ)，保留時間分別為80、200和265 min。峰Ⅰ與峰1保留時間相同，峰Ⅱ的保留時間則小于峰2，這表明高壓處理后有較大分子的蛋白質溶出，而峰Ⅲ比峰2的保留時間更長，說明高壓使常壓下可溶的部分蛋白質分子變得更小，也許這些蛋白分子發生了降解或二硫鍵的斷裂。

圖1 pH 8．0下常壓和500 MPa處理蛋白樣品凝膠色譜

為了進一步探討可溶性成分的分子特征，測定了上述不同洗脫峰組分的紫外掃描吸收曲線(圖2)。結果表明，常壓處理樣品的峰1和峰2有明顯的差別，前者只在204 nm處有較強的光吸收，后者在214 nm和270 nm處光吸收較強;而500 MPa處理樣品的峰Ⅰ和峰Ⅱ均在240 nm處表現出強烈的光吸收性，且二者吸收曲線形狀相近，但與常壓處理的樣品有顯著差異。這意味著500 MPa處理所溶出的蛋白質組分與常壓時的溶出組分具有不同的分子組成和結構特征。

圖2 不同處理樣品洗脫組分的紫外吸收曲線

2．3 可溶性蛋白和不溶性蛋白結構的分析

為了進一步探討高壓處理對熱變性大米蛋白亞基結構的影響，對不同高壓處理后可溶性部分和不溶性部分樣品進行了SDS－PAGE分析(圖3)。

圖3 不同高壓處理樣品SDS－PAGE圖譜

可以看出，不同高壓處理所得可溶部分具有相近的亞基，包括主要的14、35 ku和少量的22 ku組分;不溶部分樣品也具有相近的亞基組分，包括12、14、35、110 ku主要亞基和少量的22、26 ku亞基，這與未經高溫作用大米蛋白的亞基組成相近［16］。據文獻報道，大米中主要有13 ku的醇溶蛋白、22、37～39、57 ku的谷蛋白和少量10～200 ku的清蛋白、球蛋白［15］。熱變性米蛋白實際上是這幾種蛋白質的混合體。上述現象表明，高壓處理并沒有破壞大米蛋白的亞基結構，蛋白質的溶解性與其分子質量大小沒有直接的對應關系。這與圖1凝膠色譜分析的結果有相似之處。需要說明的是，本試驗曾對溶解性蛋白樣品進行了多次PAGE分析，但均出現嚴重拖尾現象，其原因可能是PAGE中蛋白質分子大小和帶電荷量均影響電泳速度，還可能與大米蛋白是糖蛋白有一定關系［6］。另外，水不溶性蛋白樣品在電泳時用樣品溶解液(含巰基乙醇、SDS等)也只能使部分蛋白質溶解。總之，對高壓處理后可溶及仍不溶大米蛋白組分和結構特征有待于進一步深入研究。

2．4 掃描電鏡圖譜分析(SEM)

SEM可以觀察了解蛋白質樣品的表面結構，有助于對其結構進行分析。本試驗對蛋白質樣品的SEM觀察結果(圖4)顯示:高壓處理可以改變大米蛋白樣品的表面結構。未經高壓處理的樣品表面較平滑，結構緊密，外觀呈片層狀，500 MPa高壓處理后的蛋白樣品表面膨松，呈蜂窩狀。高壓改善大米蛋白的溶解性能以及溶解的蛋白質分子表現出不同的結構特征(圖2)可能與高壓處理后蛋白質的這種結構變化有很大關系。

圖4 常壓和500 MPa處理大米蛋白掃描電鏡圖譜

3 結論

3．1 高壓可以改善大米蛋白的溶解性能。不同pH條件下，高壓處理均表現出明顯的效果。高壓處理對蛋白質分子結構或存在狀態的改變是增加其溶解性能的重要基礎。

3．2 與未高壓處理者相比，大米蛋白經高壓處理后可使較大的蛋白質分子溶出，也產生了更小的蛋白質分子，但SDS－PAGE分析顯示，高壓對大米蛋白的亞基結構沒有產生明顯影響，二者之間的確切關系有待于進一步研究。

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Effect of High－Pressure on the Solubility and Molecular Character of Rice Protein

Wang Zhangcun Cui Shengwen Tian Weihuan Zhao Xuewei Zheng Jianqiang Li Changwen Yuan Daoqiang
(School of Food＆Bioengineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002)

The effect of High Hydrostatic Pressure(HHP)processing on the solubility and molecular character of thermo－denatured rice protein was studied by Sephadex G－100 chromatography，Sodium Dodecyl Sulfate Polyacylamide Gel Electrophoresis(SDS－PAGE)and Scanning Electron Microscope(SEM)．The results showed that after treated by HHP，The ratio of soluble rice protein was increased from12．03%(at 0．1 MPa，pH 8．0)to 19．15%(after 500 MPa for 30 min，pH 8．0)and from 16．60%(at 0．1 MPa，pH 10．0)to 24．87%(after 500 MPa for 30 min，pH 10．0)receptivity;The surface of rice protein particles became loosen，the bigger molecule of the protein was dissolved in the solution and smaller molecular protein was produced，compared with that of not HHPtreated protein．The solubility rice protein produced by different pH and HHPprocessing contained 14，35 and 22 ku subunits，but the insolubility rice protein，in addition to these subunits，contained 12，16 and 110 ku subunits also．

rice protein，high pressure，solubility，molecular characterization

TS209

A

1003－0174(2012)06－0001－04

國家自然科學基金(31071517)

2011－08－19

王章存，男，1963年出生，博士，教授，糧油蛋白質深加工