基于隨機擴增多態DNA的序列特異性擴增標記法對烏蘇里貉食毛癥的分析

魏 來，付 晶，楊春山，白秀娟

（東北農業大學動物科技學院，黑龍江 哈爾濱150030）

貉（Nyctereutes）在動物分類上屬食肉目（Carnivora），犬科（Canidae），貉屬（Nyctereutesgenus），別名貉子，是珍貴的毛皮動物。其皮是制做皮大衣、皮領、皮帽的高級原料。食毛癥是籠養貉的常見病，該病導致貉被毛粗亂，輕者造成針毛、底絨參差不齊，尾根裸露；嚴重者皮膚外露，甚至出血、潰瘍，給飼養戶造成經濟損失。然而該病的發病機理和影響因素尚不明確，彭毛［1］認為食毛癥是由于日飼喂料中缺乏含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨基酸），Frank M D［2］等認為，鐵元素的缺乏會引起食毛癥的發生。也有學者認為，周圍環境和氣候的驟然變化會引起食毛癥的 發 生［3］。本試驗以 SCAR（sequnence－character amplified regions）標記對貉子食毛癥遺傳學病因進行探討，為開展貉子抗病育種的標記輔助選擇奠定基礎。李玉梅［4］、馬麗娜［5］、劉宗岳［6］等將該方法也被應用于水貂自咬癥的檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 黑龍江省大慶市泰安貉養殖基地提供飼養條件和遺傳背景均一致的烏蘇里貉87只，健康貉子56只，患食毛癥貉子31只，－20℃冷凍保存。

1.2 隨機引物的篩選 首先用160個引物分別對群體池DNA進行擴增，從中篩選出多態性豐富且條帶清晰、主帶重復性好的引物。然后用篩選出來的引物對健康和自咬樣體基因組池進行擴增。PCR擴增總體積為25μL，其中滅菌水16.3μL，10×Buffer（含鎂離子）2.5μL，dNTP（10mmol／L）2.0 μL，隨機引物2.0μL，Taq酶IU，DNA模板100 ng。反應條件：94℃預變性5min；94℃變性1min，40℃退火1min，72℃延伸1.5min，循環45次；72℃10min，4℃保存。產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。并對PCR產物進行克隆測序。

1.3 RAPD標記向SCAR標記的轉化 根據測序結果，使用PrimerPremier 5.0設計出SCAR標記的特異引物，反應體系總體積為25μL，其中滅菌水16.3μL，10×Buffer（含鎂離子）2.5μL，dNTP（10 mmol／L）2.0μL，隨機引物2.0μL，Taq酶IU，DNA模板100ng。反應條件：94℃預變性5min；94℃變性1min，43.9℃退火1min，72℃延伸1.5 min，循環45次；72℃10min，4℃保存。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 引物的篩選及健康與食毛貉子PCR電泳檢測

在160個隨機引物中，篩選出15個擴增良好且多態性較好的引物（圖1），其中，健康和食毛貉子基因組中，引物B7分別擴增出5條共有和特異性標記片1條B7－900（圖2）。

2.2 RAPD特異標記的SCAR標記轉化和驗證回收、克隆上述RAPD特異標記片段，經測序后獲得這個片段的全序列（圖3），其中，貉子B7－900基因序列的長度為867bP。將所測序列與CenBank中的Blast序列進行比較，從比較結果得知所測的B7－900擴增序列與人類角蛋白基因同源性達79%。

用SCAR引物對健康和食毛貉子進行特異性擴增，擴增結果（圖4）。引物SMB7－217在56個健康個體中有49個個體出現了和特異性目的條帶一致的條帶，其余7個個體沒有特異性條帶。在31個患病個體中有8個個體出現了和特異性目的條帶一致的條帶。卡方檢驗結果表明，特異SCAR引物在健康和食毛樣體之間的組成比例差異極顯著（P＜0.01）。說明此RAPD標記SMB7－217已成功轉化為顯性的SCAR標記（表1）。

表1 SMB7－217標記在健康和食毛個體中分布情況

3 討論

動物在生長發育過程中，經常受到各種病原物的侵襲，表現為抗病或感病。動物疾病是現代畜禽業生產的大敵，疾病不僅嚴重威脅著動物的健康，而且還給畜禽業造成巨大的經濟損失（國外估計疾病造成的經濟損失約占畜牧業總產值的12%～15%）［7］。從長遠來看，采用遺傳學方法從遺傳本質上提高動物對病原的抗性，加強免疫功能，開展抗病育種具有治本的功效。抗病力按遺傳機制不同可分為特殊抗病力和一般抗病力。特殊抗病力指畜禽對某種特定病原體的抗性，這種抗性主要受一個基因位點控制，也可不同程度的受其他多個位點及環境的影響。研究結果表明，特殊抗病力的內在機理在于宿主體內存在或缺少某種分子或其變體［8］。一般抗病力不只抗某一種病原體，它受多基因和環境的共同影響，畜體不存在一般抗病力的單基因，一般抗病力受多基因及環境影響［9］。隨著分子標記輔助選擇（MAS）技術的發展與應用，人們可以方便而快捷地進行畜禽重要經濟性狀（包括抗病力）的標記輔助選擇。標記輔助選擇已經被廣泛的運用到現代畜禽育種實踐中。

圖4 SMB7－217引物PCR擴增結果

角蛋白是外胚層細胞的結構蛋白，廣泛存在于生物體的組織結構中。在不同機體組織、不同個體乃至不同物種之間角蛋白含量有較大差異。高等脊椎動物的上皮組織中角蛋白含量較高［10］；根據是否纖維化，角蛋白可分為軟角蛋白和硬角蛋白兩大類。軟角蛋白和硬角蛋白的含硫氨基酸含量有所不同，軟角蛋白存在于皮膚和其他一些細胞組織中。纖維化的硬角蛋白，無營養作用，廣泛存在于人和動物的表皮及蛋殼的內膜中［11］。細胞外的硬角蛋白是構成毛發、羽毛、蹄、殼、爪、角、鱗片等的主要成分［12］，是結締組織及其重要的結構蛋白質，起著保護機體的作用。細胞內的軟角蛋白是構成細胞膜、腦灰質、脊髓、視網膜神經等組織的主要成分。角蛋白由L－氨基酸按一定的次序排列而成［13］，Parry 等［14］發現，動物毛發纖維的氨基酸重復單元中主要有兩種基本的五肽環模式的重復單元，即：重復單元A（CC－X－P－X）和B（C－C－X－S／T－S／T），這里 C 代表半胱氨酸（Cys），P 代表脯氨酸（Pro），S代表絲氨酸（Ser），T 代表蘇氨酸（Thr），X 代表除這幾種之外的構成蛋白質的任何一種氨基酸。由此我們推測貉子食毛癥可能與貉子機體含硫氨基酸的合成和吸收有關。這一結論與彭毛［1］的研究結果不謀而合。

本試驗采用基于RAPD的SCAR標記法對貉子食毛癥進行遺傳分析，結果表明，健康和患病貉子群體的存在較明顯的遺傳差異。這一研究結果可作為貉子食毛癥早期診斷的分子生物學手段，逐漸剔除食毛個體，達到凈化貉子群體的目的，減少貉子飼養業的經濟損失。并為進一步對貉子食毛癥的深入研究奠定基礎。

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［5］馬麗娜.水貂自咬癥分子診斷的初步研究［D］.長春：吉林農業大學，2008.

［6］劉宗岳，杜智恒，楊春山，等.水貂自咬癥SCAR標記的篩選［J］.東北林業大學學報，2010（2）：65－66.

［7］施啟順，柳小春，馬海明.豬的疾病抗性與抗病育種研究進展［J］.國外畜牧學：豬與禽，2002（3）：35－38.

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［13］孫崇榮，李玉民.蛋白質化學導論［M］.上海：復旦大學出版社，1991：4－5.

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