四川某些規模化豬場大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性監測

舒 蕾，萬 莉，張 琦，馬 磊，謝智勇，楊 映，郭 玲，顏其貴，2

（1.四川農業大學動物生物技術中心，四川 雅安625014；2.四川農業大學 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 雅安625014）

大腸桿菌病是人畜共患的腸道細菌性傳染病。在畜牧生產中致病性大腸桿菌可引發豬大腸桿菌病，主要有仔豬黃痢、仔豬白痢及仔豬水腫病典型病癥，其在規模化豬場中發病率和死亡率均較高，造成經濟損失巨大，嚴重影響養豬業的健康發展。在實際養殖生產和臨床治療過程中針對豬細菌病常使用抗生素，抗生素的濫用導致細菌產生耐藥性變化，表現出對多種抗生素具有抗性，使得細菌性疾病防治現狀嚴峻。為調查四川某地區豬源大腸桿菌耐藥性流行和發展現狀，本試驗自該地區隨機采集8個規模化豬場的仔豬黃、白痢病料，進行耐藥性監測與耐藥譜型分析，旨在為該地區臨床用藥和細菌耐藥性相關研究提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2011年3～4月期間在四川某地區隨機采集不同區域典型的8個規模化豬場進行病料收集。

1.2 實驗動物 實驗小鼠購于四川大學實驗動物中心，雌雄各半，每只體重20g±2g。

1.3 主要試劑 MH培養基、麥康凱培養基、伊紅美藍培養基，購自北京奧博星生物技術有限公司；細菌生化鑒定管和藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；藥敏質控菌株標準株ATCC2592，購自中國獸醫藥品監察所；其他試劑實驗室制備。

1.4 試驗儀器 試驗儀器均為常規設備。

1.5 病料采集 調查走訪該轄區8個規模化豬場，根據流行病學調查后收集仔豬黃、白痢發病豬的新鮮糞便80份，具體采集、保存方法參照文獻［1］進行。

1.6 病原分離純化 挑取病料與麥康凱平板上劃線接種，37℃，培養18h，挑取單個粉紅色菌落接種于伊紅美藍平板純化，37℃，培養18h，挑取有紫黑色帶金屬光澤的單個菌落于營養肉湯中，37℃搖床擴大純培養。

1.7 生化鑒定 取純化后新鮮菌液接種TSI和細菌生化鑒定管，方法及判定結果參照文獻［1］進行。

1.8 致病性試驗 用無菌生理鹽水將分離新鮮培養菌液稀釋到0.5麥氏比濁管（1×108CFU／mL），吸取稀釋菌液0.2mL分別腹腔注射健康小鼠，總體設空白對照鼠，腹腔注射無菌生理鹽水0.2mL，隔離飼養，觀察其發病及存活情況。及時剖檢死亡小鼠，取肝臟劃線于麥康凱平板進行細菌分離，染色、鏡檢結果符合大腸桿菌特征的菌株確定為致病性大腸桿菌。方法及結果判定參照文獻［1］進行。

1.9 耐藥性監測 對鑒定為致病性大腸桿菌進行藥敏試驗，試驗采用美國臨床實驗室標準委員會CLSI［2］推薦的K－B法進行，結果判定依據杭州天和微生物試劑有限公司藥敏試驗紙片法的抑菌范圍解釋標準進行。

2 結果

2.1 病原菌的分離鑒定 80份病料中分離到78株大腸桿菌，分離率為97.5%。78株大腸桿菌的TSI及生化試驗結果均符合腸桿菌科細菌生化鑒定特征，即TSI出現斜面底層變黃、有氣體；生化鑒定分離菌可發酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、木糖，產酸產氣，少數能發酵蔗糖，M.R.試驗、吲哚試驗為陽性，尿素酶、檸檬酸鹽、枸櫞酸鹽、V－P試驗為陰性。

2.2 致病性試驗 對分離出的78株大腸桿菌進行致病性試驗，其中70株接種試驗小鼠48h內死亡，取死亡小鼠肝臟分離到原接種菌，由此證明這70株大腸桿菌有致病性。

2.3 藥敏試驗

2.3.1 藥敏結果 藥敏試驗結果（表1）表明，70株不同豬場的大腸桿菌對阿莫西林、紅霉素高度耐藥，耐藥率分別為100%、82.86%，敏感性最高的為喹諾酮類氧氟沙星、頭孢類頭孢唑啉，敏感率分別為82.86%、60%，對其他5種抗菌藥物均存在較為嚴重的耐藥性，耐藥率在50%以上的有氨芐西林、慶大霉素、多西環素、氟苯尼考、環丙沙星，其中林可霉素和甲氧芐啶呈中度敏感。

2.3.2 耐藥譜 對多重耐藥性分析結果（圖1）表明，該地區的菌株對所試12種藥物表現為嚴重的多重耐藥，所有菌株至少對三種藥耐藥，最高達11耐，大部分呈6耐、8耐及9耐，總比例高達51.43%，平均耐受7種所試藥物。

表1 致病性大腸桿菌對常用抗菌藥物的耐藥性

圖1 致病性大腸桿菌對常用抗菌藥物的多重耐藥譜

2.3.3 耐藥譜型 對抗菌藥物耐藥譜型分析，共有39種耐藥譜型；其中11重耐藥譜型有2種，4重和7重耐藥譜型均有3種，3重、5重和10重耐藥譜型均有4種，8重耐藥譜型均有5種，9重耐藥譜型有6種，6重耐藥譜型均有8種。

3 討論與分析

3.1 大腸桿菌為條件性致病菌，豬瘟、傳染性胃腸炎等病毒性疾病也會繼發感染大腸桿菌病。仔豬黃、白痢的發生主要由于飼養管理不善，衛生條件差，環境溫差變化等綜合應激因素引起仔豬抵抗力降低而誘發的。所以，該地區規模化豬場應改善飼養管理，減少應激發生；產前母豬可進行疫苗免疫，通過泌乳使仔豬獲得母源抗體；積極進行藥物敏感性監測，選擇有效抗菌藥物預防；加強環境消毒，防止耐藥菌株的交叉傳播和感染；選擇使用黃芪多糖等，增強動物機體抵抗力，減少疾病發生；運用微生態制劑改善腸道微環境，防止正常菌群發生紊亂。

3.2 藥敏試驗結果真實反應了該地區各豬場在抗菌藥物的使用上有一致性，臨床使用頻率較高的藥物已對本病的防治效果不佳，如阿莫西林、紅霉素；氨芐西林、慶大霉素、多西環素、氟苯尼考、環丙沙星這幾類常用藥物存在較高耐藥性，耐藥率均大于50%，這與田國寶等［3］報道的四川地區規模化豬場大腸桿菌耐藥性有所差異，2007年四川地區敏感藥物為丁胺卡那霉素（97.3%）、新霉素（95.4%）、慶大霉素（91.7%）、頭孢唑啉（94.4%），而紅霉素、氨芐青霉素、羧芐青霉素的敏感性最低，但本次試驗結果表明，敏感藥物為氧氟沙星（82.86%），其次是頭孢唑啉（60%），敏感性明顯降低，且敏感藥物顯著減少；所有試驗菌株至少對3種藥耐藥，豬源大腸桿菌多重耐藥現象非常嚴重，這與林居純等［4］對我國不同地區大腸桿菌有多重耐藥性結果相似。本次試驗地區有51.43%的菌株耐藥譜達7耐及7耐以上，這相比陳希文等［5］報道的四川綿陽地區豬源致病性大腸桿菌的耐藥譜有所降低；對耐藥譜型分析結果與楊澤曉等［6］對四川省部分地區大腸桿菌的耐藥性監測結論一致，相同耐藥程度的分離菌有多種耐藥譜型，耐藥譜型在增寬。且慶大霉素、紅霉素、環丙沙星的耐藥率高于四川其他地區。這與不同地區菌株的遺傳差異、豬場臨床用藥差異等因素有關。

細菌的耐藥性通過染色體或質粒介導在細菌間傳播和擴散，不合理或濫用抗生素加速了豬大腸桿菌耐藥性的產生和擴散，這導致畜牧業疾病防治用藥難度加大。通過本次試驗得出，該地區豬場在臨床防治中應選用敏感性高的氧氟沙星、頭孢唑啉，禁止使用耐藥程度高的阿莫西林、紅霉素，對其他中度敏感藥物可合理采取聯合、交叉、輪換用藥。

3.3 近年來新耐藥菌株的出現，給獸醫臨床施藥帶來巨大考驗，促使我們開發新型藥物。在獸醫臨床用藥中使用抗生素時我們要正確診斷、對癥下藥，掌握藥性，正確選藥，規范用法，合理劑量，注意個體差異，加強飼養管理；另外，中獸藥在獸醫臨床用藥中應用逐漸增多，中藥為天然植物，具有低殘留、毒副作用小、藥效時間長、不易產生耐藥性等優點，其療效也逐漸被公眾所認可，越加凸顯其優勢。已有研究證實，中藥是直接作用于細菌的結構和代謝而產生抗菌作用［7］，張庭延等［8］從中藥金櫻子中提取出多糖類物質進行體外抑菌試驗，結果對大腸桿菌等具有很強抑制作用。因此，將中藥運用于規模化豬場疾病的防治中，是解決耐藥問題的另一途徑。

［1］陸承平.獸醫微生物學［M］.北京：中國農業出版社，2007：215－223.

［2］CLSI Document M31－S1，Clinical and Laboratory Standards Institute［S］.

［3］田國寶，王紅寧，黃勇，等.規模化豬場大腸桿菌耐藥性和血清型變化趨勢［J］.中國獸醫雜志，2007，43（10）：31－33.

［4］林居純，卓家珍，蔣紅霞，等.不同地區豬源和禽源大腸桿菌耐藥性監測［J］.華南農業大學學報，2009，30（1）：86－88.

［5］陳希文，王雄清，代敏，等.綿陽地區豬源致病性大腸桿菌的耐藥性監測［J］.江蘇農業科學，2007（1）：131－134.

［6］楊澤曉，龐歌，王印，等.四川省部分地區大腸桿菌的耐藥性監測［J］.畜牧與獸醫，2011，43（2）：84－87.

［7］解慶林，鄒堂斌，潘百明，等.中藥抗菌作用及逆轉耐藥性機制研究［J］.中獸醫醫藥雜志，2010（5）：30－31.

［8］張庭延，聶劉旺，劉愛民，等.金櫻子多糖的免疫活性研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2005，11（4）：55－58.