牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及初步應用

陳其兵，薛 霜，漆世華，朱 薇，張 萍，謝紅玲，溫文生，吳玉石

(武漢中博生物股份有限公司，武漢 430070)

牛病毒性腹瀉病(bovine viral diarrhea，BVD)是一種在世界范圍內廣泛傳播的牛羊傳染病，其病原為黃病毒科瘟病毒屬的牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)。BVDV 是危害養牛業、養羊業和養豬業的重要病原之一，能引起感染動物產生以腹瀉為主的一系列復雜的臨床癥狀[1-3]。BVDV 感染可發生于子宮內[4]，垂直感染使得胎牛血清、豬瘟細胞疫苗等很難控制BVDV污染，給畜牧業及相關生物制品領域造成了重大經濟損失。

檢測BVDV的方法很多，主要包括血清學中和試驗、細胞分離培養、酶聯免疫吸附試驗、PCR技術等。血清學方法多存在費時、費力、準確率低等缺點。我國診斷BVDV國家標準技術采用培養細胞分離病毒的方法，但該方法費時費力，加之病毒分離率低，有些非致細胞病變型BVDV在細胞培養中不出現細胞病變，因而不利于大規模應用檢測[5-6]。近幾年發展起來的實時熒光定量PCR技術將傳統PCR與熒光檢測方法相結合，具有操作簡便、結果直觀、敏感性高、特異性強、重復性好等優點，已成為病原檢測的重要方法。本研究建立了一種特異性的BVDV熒光定量RT-PCR快速檢測方法，可用于BVDV的臨床輔助診斷、快速定量檢測以及對生物制品中是否污染BVDV進行監測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生物材料 牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒、豬瘟疫苗毒、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、MDBK細胞、胎牛血清由武漢中博生物股份有限公司保存，大腸桿菌DH5α感受態細胞購自北京全式金生物公司。

1.1.2 主要試劑 BamHⅠ限制性內切酶、TaqDNA聚合酶、M-MLV反轉錄酶、RNase Inhibitor、DNaseⅠ、T7體外轉錄試劑盒、DNA 片段回收純化試劑盒、質粒快速提取試劑盒、病毒核酸提取試劑盒、熒光定量RT-PCR試劑盒(探針法)均購自大連寶生物工程有限公司，pEASY-T1克隆載體購自北京全式金公司。

1.2 方法

1.2.1 引物及探針設計 通過分析BVDV的保守基因片段，并結合熒光PCR引物探針設計特點，利用DNAStar軟件進行同源性排序分析比較，選出在BVDV 5’UTR序列中種內保守種間特異的核苷酸片段，然后利用Primer Express及DNAStar軟件設計篩選出最佳引物和探針組合，確定為本方法中所使用的引物和探針。

1.2.2 定量標準品的制備

1.2.2.1 體外轉錄模板的制備 以提取的BVDV核酸為模板擴增目的基因片段，經回收純化后將其連接至pEASY-T1載體上。連接產物轉化DH5α感受態細胞，經過抗性篩選、擴大培養后提取質粒。將經PCR初步鑒定為陽性的質粒送生物公司測序鑒定并及時保存陽性菌液和質粒。

1.2.2.2 體外轉錄標準品 將構建的陽性重組質粒經BamHⅠ酶切使質粒線性化，T7 RNA聚合酶37℃體外轉錄2 h，DNaseⅠ消化去除模板 DNA，酚/氯仿/異戊醇抽提純化RNA，置于-70℃保存備用。經紫外分光光度計測定含量(連續測定5次取平均值)，計算出每微升所含的拷貝數并進行10倍梯度稀釋，作為定量標準品。

1.2.3 熒光定量RT-PCR檢測方法的建立

1.2.3.1 反應條件的優化 根據寶生物One Step PrimeScript RT-PCR試劑盒說明書，用所制備的標準品對PCR反應條件和體系進行優化。

1.2.3.2 特異性實驗 在相同的條件下，同時對未接毒的MDBK細胞、牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒、豬瘟疫苗毒和豬繁殖與呼吸綜合癥病毒提取核酸。應用優化后的PCR體系及條件對上述樣品進行檢測，同時以定量標準品和無菌水分別作為陽性和陰性對照，驗證所建立檢測方法的特異性。

1.2.3.3 敏感性試驗 以10倍梯度稀釋的標準品作為模板進行RT-PCR，得到相關標準曲線，確定最低檢出量。

1.2.3.4 重復性試驗 用所建立的方法對3組不同病毒含量的樣品進行重復性測定，所得檢測結果經統計學處理后，計算組內的變異系數(CV)。

1.3 臨床樣品的檢測 用所建立的方法對10份胎牛血清樣品和10份豬瘟細胞苗半成品進行檢測，同時設立陰、陽性對照，計算陽性檢出率。

2 實驗結果

2.1 引物、探針設計 通過分析BVDV-Ⅰ型的保守基因片段，并結合熒光PCR引物探針設計特點，利用DNAStar軟件進行同源性排序分析比較，選出在5’UTR序列中種內保守種間特異的核苷酸片段，然后利用Primer Express及DNAStar軟件設計篩選出最佳引物和探針組合，確定為本方法中所使用的引物和探針(表1)。

表1 BVDV熒光定量RT-PCR引物和探針

2.2 反應條件優化 經相關實驗優化后的反應體系和反應條件為:2×One Step RT-PCR BufferⅢ10 μL、10 μM TaqMan 探針 0.4 μL、10 μM 上游引物 0.4 μL、10 μM 下游引物 0.4 μL、TaKaRa Ex Taq HS 0.4 μL、Prime-Script RT Enzyme MixⅡ 0.4 μL、Rox Reference Dye 0.4 μL、DEPC H2O 5.6 μL、模板 2 μL。

擴增條件為:42℃ 5 min，95℃ 10 s，1個循環;95℃ 5 s，60℃ 40 s(收集熒光FAM)，40個循環。

2.3 特異性試驗 結果顯示，牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒和陽性對照品檢測結果為陽性，而豬瘟細胞毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、MDBK細胞和陰性對照品均為陰性(圖1)。證明所建立的方法能特異性的檢測出牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒。

圖1 特異性試驗結果

2.4 敏感性試驗 以十倍系列稀釋的BVDV轉錄RNA標準品(2.15×102～2.15×108拷貝/μL)作為模板進行檢測，結果顯示，在2.15×102～2.15×108拷貝/μL的范圍內可以得到良好的動力學曲線(圖2)且標準曲線較為理想(圖3)。標準曲線的線性相關系數(R2)在0.99以上，提示誤差較小，可信度較高。說明本方法可檢測低至103～104拷貝/mL的病毒量。

2.5 重復性試驗 所得檢測結果經統計學處理后，計算組內的變異系數(CV)，結果顯示CV值均小于3%，說明差異不顯著，該檢測方法重復性較好(表2)。

表2 樣品組間重復性檢測

2.6 臨床樣品的檢測 在所檢測20份樣品中，其中胎牛血清樣品BVDV陽性4份(4/10)，豬瘟細胞苗半成品BVDV陽性2份(2/10)。陽性檢出率為30%，且陰、陽性對照均成立，檢測結果見圖4。

圖4 臨床樣品檢測結果

3 討論

牛病毒性腹瀉病至今仍是世界范圍內嚴重威脅養牛業健康發展的傳染病，世界各國對該病都十分重視，對其展開的研究力度逐年都在增加，近幾年來我國牛感染BVDV并持續帶毒的現象時有發生[7]。由于BVDV與豬瘟病毒同屬于黃病毒科瘟病毒屬的成員，具有較近的親緣關系，兩者的氨基酸同源性約為85%[8]，在血清學上存在交叉反應，因而血清學方法難以區分BVDV和CSFV。在生產豬瘟細胞疫苗的過程中會用到胎牛血清、牛睪丸細胞等牛源制品，一旦這些制品中污染了BVDV，便會造成豬瘟細胞疫苗的污染。據相關報道，豬使用污染了BVDV的豬瘟疫苗后可感染BVDV，出現類似于豬瘟的臨床癥狀和病理變化。另外，用含BVDV抗原和抗體的牛血清也會干擾豬瘟病毒的體外培養[9]。因而建立特異敏感的BVDV檢測方法，有利于保障牛血清、豬瘟細胞活疫苗等的質量。

目前BVDV的診斷技術研究水平遠遠滯后于其他方面的研究進展，如何建立快速、準確的檢測方法是當前BVDV防制工作的迫切要求。實時定量PCR方法操作簡便、快速高效、具有較高的敏感度和特異性，而且封閉性好、不需要后續處理，大大降低了污染的可能性。顯著的優越性使得該方法不僅在生物技術方面應用廣泛，現今更作為一種診斷方法應用于臨床。本研究建立了一種能夠快速、特異、靈敏的檢測BVDV的熒光定量RT-PCR方法，通過對20份胎牛血清和豬瘟細胞疫苗樣品進行檢測，發現其中6份樣品污染了BVDV(6/20)。實驗證實所建立的檢測方法簡便、快捷，具有較好的特異性、敏感性且重復性好。可用于臨床及科研中對BVDV的快速定量檢測和對牛血清及豬瘟兔化弱毒疫苗等生物制品中是否污染BVDV進行監測。但本研究中的引物和探針序列是根據BVDV-Ⅰ型設計的，豬瘟疫苗中是否有BVDV-Ⅱ型毒株的污染尚需用多種方法進一步檢測才能確定。

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