黃精多糖肽的單糖組成和抗氧化活性*

梁引庫，吳三橋，徐仲陽，李新生，楊海濤，劉軍海

1(陜西理工學(xué)院陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西漢中，723000)2(陜西理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西漢中，723000)3(青海省農(nóng)林科學(xué)院，青海西寧，810016)

黃精又名老虎姜、雞頭參、玉竹，始載于《名醫(yī)別錄》，屬于百合科(Liliaceae)黃精屬(Polygouatum)。有滇黃精(Polygonatum kingianum Coll.)、黃精(Polygonatum sibiricum Red.)或多花黃精(Polygonatum cyrtonema Hua.)的干燥根莖。黃精中主要成分是黃精多糖(Polygonatum sibiricum polysaccharides，PSP.)，黃精多糖能調(diào)脂，抑制動(dòng)物動(dòng)脈粥樣硬化［1－2］，顯著降低腎上腺素誘發(fā)的高血糖小鼠的血糖值［3］，延長果蠅的平均壽命和最高壽命［4］，能對抗環(huán)磷酰胺所致小鼠外周血白細(xì)胞的減少，具有抗貧血的作用［5］。此外，黃精多糖具有抗病毒及免疫激發(fā)作用，能提高小鼠的免疫能力［6－8］。黃芳等報(bào)道從菌體中提取的一般由葡聚糖組成的活性多糖具有一定的抗腫瘤活性［9］，例如從豬苓中提取菌體中提取的多糖組分其抗腫瘤成分是帶(1－6)支鏈的 β-(1，3)-D-葡聚糖［10］;從香菇中提取的具有抗腫瘤活性的也是由β-1，3結(jié)合的直連葡聚糖構(gòu)成。因此多糖的單糖組成對其活性具有重要的影響［11］。而黃精多糖肽又是黃精多糖的主要組成成分，多糖肽是多糖與蛋白質(zhì)的復(fù)合體，研究表明多糖中多糖肽具有重要的藥理學(xué)作用，而且肽類化合物與多糖等混合藥理作用往往超過單純的多糖和多肽［12，14］。而現(xiàn)今對黃精多糖肽的研究卻鮮有報(bào)道。本研究以漢中黃精為研究對象，通過提取、分離和純化等步驟分離純化黃精多糖肽，并對黃精中的多糖肽的單糖組分和抗氧化活性進(jìn)行系統(tǒng)的分析研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料

黃精，購于漢中藥材市場，經(jīng)陜西理工學(xué)院李新生教授鑒定為黃精塊莖。黃精經(jīng)洗凈、烘干、粉碎并過40目篩備用。

1.1.2 試劑

鼠李糖、阿拉伯糖、D-木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，均為色譜純;鹽酸羥胺、吡啶、醋酸酐、蒽酮、牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、甲醇、三氟乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、番紅花紅、乙二胺四乙酸二鈉、濃硫酸、濃磷酸、硫酸鈉、鉬酸銨、三羥基甲烷、鹽酸(37.5%)、鄰苯三酚、VC、體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇、體積分?jǐn)?shù)30%的H2O2等試劑，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV2550型紫外分光光度計(jì)(日本島津科學(xué)儀器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)，JD-150E型超聲波清洗機(jī)(寧波金達(dá)超聲波儀器廠)，HH-S4型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)，F(xiàn)A2204B型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，TDZ4-WS低速臺(tái)式離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，中草藥粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(武進(jìn)電控儀器廠)，GC-MS ITQ900氣相色譜質(zhì)譜儀(美國熱電)，OSO-T8260美國聯(lián)合碳化透析袋MD25。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 多糖肽的提取

將干燥的黃精粉碎，稱取150 g的黃精粉末，按料液比1∶10采用80℃水提法提取，過濾得提取液，重復(fù)提取3次，合并濾液并濃縮至1/5體積，然后加入乙醇使乙醇體積分?jǐn)?shù)最終為80%，醇沉淀12 h，4 000 r/min離心10 min得沉淀，沉淀80℃烘干備用，即為多糖肽粗品。

2.2 多糖肽的純化

用無離子水溶解粗多糖肽，加入 三氯乙酸使其最終濃度為3%，搖勻，冷藏過夜，而后4 000 r/min離心10 min，取上清液，除去游離蛋白質(zhì)。然后用截留分子質(zhì)量14 000 u的透析袋透析24h并濃縮至1/10體積，加乙醇使乙醇最終體積分?jǐn)?shù)為80%，4℃醇沉12 h，4 000 r/min離心10 min，得到沉淀。取一定量的沉淀上DEAE-52纖維素柱，用無離子水洗脫多糖，直至用硫酸-蒽酮法測定無多糖洗出時(shí)，再用0.4 mol/L NaCl溶液洗脫3個(gè)柱體積，合并洗脫溶液，即為純化的黃精多糖肽提取液。

2.3 硫酸-蒽酮法測糖含量

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取200 mg干燥至衡重的葡萄糖，定容至1 000 mL為儲(chǔ)備液;取7支干凈試管，分別移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 和 1.2 mL 葡萄糖儲(chǔ)備液，而后再分別加2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0 和 0.8 mL 無離子水，硫酸蒽酮法測定葡萄糖含量［15］，以濃度為橫坐標(biāo)吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，得回歸方程為y=4.84x+0.0749，R2=0.988 8，線性關(guān)系良好。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 多糖肽中糖含量測定

取3只干凈試管，分別加入經(jīng)2.1和2.2步驟純化的黃精多糖肽2.0 mL和2 mL無離子水，同標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定多糖肽的糖含量。

2.4 考馬斯亮藍(lán)G-250測蛋白質(zhì)含量

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取10 mg牛血清蛋白配制0.1 mg/mL的原液。稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50 mL 90%乙醇中，加入0.85 g/mL的磷酸100 mL，最后用無離子水定容到1 000 mL。取6支干凈的具塞試管，分別配制濃度為 0、20、40、60、80、100、120 μg/mL 蛋白溶，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量然后以以濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，得回歸方程為y=5.433x+0.002 8，R20.987 4，線性關(guān)系良好。

圖2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2 蛋白質(zhì)含量測定

取3只干凈試管，分別加入經(jīng)2.1和2.2步驟純化的黃精多糖肽1.0 mL和1 mL無離子水，考馬斯亮藍(lán)法測定黃精多糖肽中蛋白質(zhì)的含量。

2.5 GC-MS測定多糖肽單糖組成

2.5.1 多糖肽水解

取20 mL多糖肽溶液減壓烘干，加入5 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，100℃下密封水解12 h，取出揮干。加少量的甲醇搖勻后揮干，重復(fù)此過程3次，之后80℃下干燥樣品12 h。

2.5.2 單糖肽衍生化

稱取多糖水解樣品10 mg，加入10 mg鹽酸羥胺和0.5 mL吡啶，放入90℃水浴加熱反應(yīng)30 min，并不時(shí)振蕩。取出后冷卻至室溫，再加入0.5 mL醋酸酐，在90℃水浴中繼續(xù)反應(yīng)30 min，即為糖腈乙酸脂衍生物。

2.5.3 GC-MS分析條件

GC條件:分離柱:TG-SQC型，(30.0×0.25)mm毛細(xì)管柱，膜厚:0.25 μm;載氣:氦氣(99.99%);流量:1 mL/min;進(jìn)樣口溫度:200℃;升溫程序:160℃保留1 min，3℃/min升溫至200℃保留2 min;分流比:7。MS條件:EI離子源:70eV;離子源溫度:250℃;傳輸線溫度:250℃;溶劑延遲:5 min;掃描質(zhì)量范圍:30～600 amu。

2.6 抗氧化活性的測定

2.6.1 羥自由基的清除

取0.15 mol/L pH 7.4的磷酸緩沖溶液1.0 mL，40 μg/mL 的番紅花紅 1.0 mL，0.945 mmol/L EDTAFe(II)(新鮮配置)1.0 mL，不同濃度的樣品溶液0.5 mL，3%H2O221.0 mL(新鮮配置)，混合后在37℃水浴中反應(yīng)30 min后在520 nm處測定吸光度As。空白組以0.5 mL無離子水代替樣品測定吸光度Ao。對照組以1.5 mL無離子水代替H2O2和樣品測定吸光度A，用3.5 mL無離子水代替番紅花紅、EDTA-Fe(II)、H2O2和樣品，pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液調(diào)零。并按下式計(jì)算清除率［16］:

2.6.2 總抗氧化活性的測定(磷鉬絡(luò)合物法)

在10 mL比色管中，分別加入4 mL磷鉬試劑液，0.4 mL樣品，95℃水浴中恒溫90 min，在695 nm波長下測定吸光度 A［17］。

2.6.3 超氧陰離子自由基清除作用

取pH值為8.2的Tris-HCl緩沖液9 mL于25℃恒溫水浴20 min后，用微量注射器注入40 μL，于25℃預(yù)熱過的鄰苯三酚溶液立即倒入比色管中，于溫度25℃下每隔30秒測定一次吸光度(420 nm自氧化速率控制在0.06·min－1左右)，鄰苯三酚自氧化3 min后，加1滴0.08 mg/mL的Vc立即混勻，室溫下放置5 min后測定其在420 nm下的吸光度即A0，可表示鄰苯三酚的自氧化速率［18］。在上述Tris-HCl緩沖液中加入一定量的樣品，再接上述方法測定鄰苯三酚的自氧化速率得到A1，同時(shí)做一空白試劑A2，按下式計(jì)算:

3 結(jié)果與分析

3.1 黃精多糖肽的含量

經(jīng)2.1和2.2步驟分離純化的黃精多糖肽溶液經(jīng)檢測知，純化黃精多糖肽中多糖濃度為0.081 mg/mL，蛋白質(zhì)濃度為0.015 mg/mL，因此提取液黃精多糖肽濃度為0.096 mg/mL，黃精中多糖肽的含量為0.34%，黃精多糖肽中多糖與蛋白質(zhì)比率為5.4∶1。

3.2 GC-MS測定的多糖肽單糖組成

GC-MS分析表明，鼠李糖、阿拉伯糖、D-木糖、甘聚糖、葡萄糖和半乳糖經(jīng)過衍生化后GC-MS檢測，其RT 分別為:6.02、6.31、6.55、11.12、11.42 和 12.00 min。GC-MS分析黃精多糖肽，黃精多糖肽的單糖組成分別為:鼠李糖、阿拉伯糖、D-木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其相對百分含量分別為:2.12%、1.81%、2.51%、65.4%、14.3%、13.8%。黃精多糖肽中的單糖主要是甘露糖，甘露糖含量最高，可達(dá)65.4%;而阿拉伯糖含量最低，為1.81%。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)單糖和樣品的GC-MS圖

3.3 抗氧化活性測定結(jié)果

3.3.1 對羥基自由基的清除作用——Fenton氧化法

圖4表明，隨著黃精多糖肽和Vc濃度的增高，黃精多糖肽和Vc對羥基自由基的清除率也逐漸增高，當(dāng)其濃度達(dá)到0.12 mg/mL時(shí)，黃精多糖肽和Vc對羥基自由基的清除率也達(dá)到最高，此時(shí)黃精多糖肽和Vc對羥基自由基的清除率分別為56.76%和35.7%。在相同濃度下黃精多糖肽對羥基自由基的清除率高于Vc的清除率，尤其是在高濃度條件下其對羥基自由基的清除率顯著高于Vc對羥基自由基的清除率。

圖4 黃精多糖肽對羥基自由基的清除

3.3.2 總抗氧化活性—磷鉬絡(luò)合物法

圖5表明，黃精多糖肽總抗氧化活性隨著濃度的增加而增加，當(dāng)黃精多糖肽的濃度達(dá)到0.12 mg/mL時(shí)其總抗氧化活性最高，黃精多糖肽具有較好的抗氧化活性。而在相同濃度下黃精多糖肽的總抗氧化活性低于Vc的總抗氧化活性。

圖5 黃精多糖肽和Vc的總抗氧化活性

3.3.3 超氧陰離子自由基清楚作用(鄰苯三酚自氧化法)

本實(shí)驗(yàn)采用鄰苯三酚自氧化法測試了黃精多糖肽和Vc對鄰苯三酚自氧化過程中產(chǎn)生的超氧陰離子的清除作用。圖6表明，黃精多糖肽和Vc對超氧陰離子的清除能力隨著濃度的升高而增加，當(dāng)黃精多糖肽和Vc的濃度達(dá)到0.12 mg/mL時(shí)其對超氧陰離子的抑制率達(dá)到最大，分別為51.2%和42.8%。由此可見，黃精多糖肽對超氧陰離子自由基具有較強(qiáng)的抑制效果。相同濃度下與Vc相比，黃精多糖肽對超氧陰離子的清除率顯著高于Vc的清除率。

圖6 黃精多糖肽對超氧陰離子的抑制率

4 結(jié)論

在本研究中，分別對標(biāo)準(zhǔn)單糖進(jìn)行了衍生化處理，確定了單糖的RT，但在GC-MS分析過程中發(fā)現(xiàn)，單糖衍生化處理過程中出現(xiàn)了多種雜峰，經(jīng)GC-MS自帶數(shù)據(jù)庫分析表明這些雜峰是單糖衍生化過程中生成的其它糖腈乙酸脂衍生物，屬于附帶反應(yīng)。單糖衍生化分析表明，反應(yīng)過程中產(chǎn)生的雜峰不影響各種單糖衍生化產(chǎn)生的特征峰，而且分析發(fā)現(xiàn)各種特征峰隨著其濃度的增大而增大，特征峰與單糖具有較好的量效關(guān)系，因此單糖衍生化產(chǎn)生的這種特征峰可以表征單糖。多糖肽水解及衍生化分析發(fā)現(xiàn)，衍生化處理后，GC-MS圖譜同樣出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生化產(chǎn)生的相同雜峰，扣除后雜峰后表明黃精多糖肽的單糖組成主要是鼠李糖、阿拉伯糖、D-木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等，其相對百分含量分別為:2.12%、1.81%、2.51%、65.4%、14.3%、13.8%。分別檢測黃精多糖肽中的蛋白質(zhì)和多糖發(fā)現(xiàn)，黃精中多糖肽的含量為0.34% ，其中多糖與蛋白質(zhì)的比率為5.4∶1;黃精多糖肽的抗氧化活性表明，黃精多糖肽具有較好的抗氧化活性，對超氧陰離子和羥基自由基具有明顯的抑制作用，在總抗氧化能力實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的活性，并且呈明顯的量效關(guān)系;不過黃精多糖肽的對羥基自由基及超氧陰離子的清除高于Vc，總抗氧化活性則顯著低于Vc。這說明黃精多糖肽可能具有抗炎、抗衰老等方面的活性。

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