雙菌種制曲改善黃酒麥曲品質的研究*

余培斌，陳亮亮，張波，李國龍，謝廣發，蔡國林，陸健

1(江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫，214122)2(江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)3(江南大學 生物工程學院，江蘇無錫，214122)4(中國紹興黃酒集團有限公司國家黃酒工程技術研究中心，浙江紹興，312000)

黃酒是以稻米、黍米、玉米、小米、小麥等為主要原料，經蒸煮、加曲、糖化、發酵、壓榨、過濾、煎酒、貯存、勾兌而成的釀造酒［1］，“以麥制曲，用曲釀酒”是黃酒的特色［2］。麥曲作為黃酒生產的配料，其中含有多種微生物及其代謝產物，給黃酒釀造提供所需的酶，主要是淀粉酶和蛋白酶，淀粉酶把淀粉質原料分解為低分子糖類，為酵母等微生物提供碳源及能量;蛋白酶分解蛋白質成肽和氨基酸等，為微生物的生長、繁殖提供營養物質的同時，也是黃酒中風味物質形成的前體。

麥曲分為生麥曲和熟麥曲，生麥曲采用傳統制曲工藝，利用生料，自然接種。麥曲中網羅了多種微生物，形成了特定的微生物群落，所釀的酒口味醇厚，香氣較濃，但由于生麥曲是自然培養，曲中主要酶類的活性都較低，在實際生產中用量較大，添加比例約為17%左右，釀造過程中發酵緩慢，殘糖高，后續處理時，壓榨困難［3］。熟麥曲是在傳統制曲的基礎上發展起來的新技術，利用熟料，接種純種米曲霉蘇－16進行培養。熟麥曲中淀粉酶活得到了顯著提高，但由于菌種單一，酶系簡單，所釀的黃酒口味寡淡，雜味較重。因此，改善黃酒麥曲品質，可以考慮多菌種組合制曲。林祖申等采用米曲霉、黑曲霉混合制曲，明顯提高醬油質量［4－5］，倪崢飛通過強化從醋醅中分離得到的多株功能微生物，縮短了鎮江香醋的發酵周期，同時也提高了香醋中的功能性物質的含量［6］，在研究固態發酵飼料方面，也采用混菌發酵［7－8］。

在前期的研究中，本實驗室從黃酒工廠的成品麥曲、原料、曲房、黃酒發酵液、周圍空氣等多種環境中分離到多株真菌，本文以這些真菌為出發菌株，篩選能夠影響麥曲質量的功能微生物，通過生物強化技術，與傳統熟麥曲菌種混合發酵，以改善黃酒麥曲的品質，并對制曲條件進行了初步優化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基

1.1.1.1 斜面培養基

PDA培養基:取去皮馬鈴薯200 g，切塊，加1 000 mL蒸餾水，煮沸20 min后紗布過濾，補加蒸餾水至1 000 mL，加葡萄糖20 g，瓊脂20 g，pH自然。

1.1.1.2 初篩培養基

產淀粉酶微生物初篩培養基:可溶性淀粉3 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏3～5 g/L，NaCl 5 g/L瓊脂2% ，pH 7.2～7.4。

產蛋白酶微生物初篩培養基:牛肉膏5 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 5 g/L，脫脂奶粉 3 g/L，瓊脂 2%，pH 7.0～7.2。

1.1.2 原料與試劑

粉碎小麥由紹興某黃酒廠制曲車間提供，麩皮購自無錫三里橋農貿市場。菌株自紹興某黃酒廠環境中分離得到，由實驗室保藏。

試劑:3，5-二硝基水楊酸、福林試劑、淀粉、三氯乙酸、酪素、碳酸鈉、瓊脂粉等，均為分析純，購自上海國藥化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分生孢子懸液的制備

將活化后菌種的分生孢子用無菌水洗入三角瓶中，在超凈臺上用4層擦鏡紙過濾，旋渦振蕩均勻，血球計數板計數，孢子濃度調為107個/mL。

1.2.2 高產淀粉酶及蛋白酶微生物的篩選

(1)初篩:取9 cm滅菌過的培養皿，每個加入初篩培養基20 mL，將原有保藏的菌種點植法接種到培養皿中，每皿點種3株霉菌，30℃培養箱培養2～3 d，觀察并定期測量菌落周圍水解透明圈大小。

(2)復篩:根據初篩結果，從平板中挑選透明圈明顯的菌株，做孢子懸液，制作純種熟麥曲，以糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶酶活為篩選指標，挑選酶活最高者作為目標菌株。

1.2.3 菌種鑒定

(1)菌株形態鑒定。根據文獻［9］介紹的方法和分類依據進行初步的分類鑒定。

(2)菌株分子鑒定。染色體DNA的提取、核糖體內轉錄間隔區(ITS)的擴增和克隆測序:采用文獻［10］中的氯化芐法。采用真菌通用引物ITS1(5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)和ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)［11］擴增真菌 ITS區域。純菌株的PCR產物通過PCR產物純化試劑盒純化后由上海生工生物工程技術有限公司測序，測序結果在NCBI網站進行序列比對。

1.2.4 純種熟麥曲制曲工藝流程

純種熟麥曲的制做參考文獻［12］中相關章節，結合實驗室做曲的特殊情況，將種曲接種改為孢子懸浮液接種。

1.2.5 粗酶液制備

(1)麥曲粗淀粉酶:稱麥曲10 g，加入1%NaCl溶液50 mL，30℃恒溫水浴1 h，每15 min搖晃1次，濾紙過濾，得粗酶液。

(2)麥曲粗蛋白酶:稱麥曲10 g，加入pH3.0乳酸-乳酸鈉緩沖液50 mL，30℃恒溫水浴1 h，每15 min搖晃1次，濾紙過濾，得粗酶液。

1.2.6 酶活的測定及定義

(1)糖化酶酶活測定:參照方華［13］的測定方法。

酶活定義:1 g干曲經緩沖液提取后的粗酶液，在40℃，pH為4.6的條件下，1 h分解可溶性淀粉產生1 mg葡萄糖為1個酶活單位，以U/g表示。

(2)α-淀粉酶酶的測定:采用鈍化法測定［14］。

酶活定義:1 g干曲經緩沖液提取后的粗酶液，在60℃，pH 4.6的條件下，每分鐘分解可溶性淀粉產生1 mg麥芽糖為1個酶活單位，以U/g表示。

(3)蛋白酶酶活測定:采用福林酚法［15］。

參照中華人民共和國專業標準蛋白酶活測定法(QB/T 1803－1993)。酸性蛋白酶測定pH為3.0。酶活定義:1 g干曲經緩沖液提取后的粗酶液，在40℃條件下每分鐘水解酪素產生1 μg酪氨酸為1個蛋白酶活單位，以U/g表示。

1.3 麥曲培養條件優化

1.3.1 單因素實驗

響應面擬合方程只在考察的緊接區域里才能充分近似真實情形，所以要先逼近最佳值區域后才能建立有效的響應面擬合方程。結合工廠的實際，分別以培養時間、接種量、原料含水量為因素，以麥曲中蛋白酶、α-淀粉酶、糖化酶酶活為指標，進行單因素實驗。

1.3.2 響應面法實驗設計

采用Central Composite Design建立數學模型，選用3因素3水平的響應面分析方法，以培養時間、接種量、原料含水量為主要考察因素，合理選擇各因素水平，各因素水平及編碼如表1所示，利用Design Expert 7.0版本軟件對實驗數據進行回歸分析。該模型通過最小二乘法擬合二次多項方程可以表達為:Y

表1 響應面試驗因素及水平

2 結果與分析

2.1 高產淀粉酶及蛋白酶菌株的篩選

實驗室保藏的從酒廠中分離得到的微生物(主要為真菌)共121株，經平板初篩，得到能產淀粉酶的菌株為15株，能產酸性蛋白酶的菌株13株，其中有8株菌既能產淀粉酶也能產酸性蛋白酶，將這20株菌做成純種熟麥曲，測定酶活，進行復篩，得到產較高淀粉酶和酸性蛋白酶酶活的菌株2株，編號為ZW12和 GC3，2株菌與傳統熟麥曲所用菌株米曲霉蘇－16的酶活比較，見表2。

表2 不同菌株酶活比較

2.2 菌株GC3和ZW12的鑒定

2.2.1 菌株GC3和ZW12的培養形態特征

GC3菌株菌落生長快，在PDA平板上30℃培養24 h后，出現白色菌落，36 h后長滿整個平板，菌落蓬松成棉絮絲狀，白色菌絲中出現黑色孢子，背面無色。顯微觀察:菌絲匍匐爬行，假根發達，分枝呈指狀或根狀，孢囊梗直立，2～4株成束，與假根對生，頂端膨大形成圓形的孢子囊，囊內產生孢囊孢子(見圖1)。ZW12菌株菌落生長較慢，在PDA平板上，30℃培養24 h后，出現一小團白色菌落，菌落直徑約5 mm，36 h后，菌落變大且中間有白色棉絮突起，約40～60 mm，產生大量黃綠色孢子，背面出現淺淺的橘紅色。顯微觀察發現:分生孢子頭放射狀，頂囊近球形，分生孢子幼時橢圓形，成熟后為球形或近球形(見圖2)。

2.2.2 菌株rDNA的ITS序列分析

對真菌GC3和ZW12的總DNA進行提取，以總DNA為模板，利用真菌通用引物ITSl和ITS4進行PCR擴增得到ITSl—5.8S—ITS2序列，PCR產物大小約為750 bp，對回收純化的PCR產物進行測序比對，結果表明，GC3的ITS序列同米根霉(Rhizopus oryzae)18S rDNA的ITS序列同源性為100%，真菌ZW12的序列同米曲霉(Aspergillus oryzae)18S rDNA的ITS序列同源性為99%，同時結合形態學分析，將GC3鑒定為米根霉，將ZW12鑒定為米曲霉。

圖2 菌株ZW12的宏觀及微觀形態特征

2.3 制曲菌株及混合比例的確定

將篩選出來的2株菌ZW12，GC3分別與米曲霉蘇－16混合制曲，混合時使用孢子懸浮液進行，接種量為每50 g原料接種混合好的孢子懸浮液2 mL，在總接種量不變的情況下，改變混合比例，確定用于制曲的菌株及最優的混合比例，結果見表3。由圖3可知在米曲霉蘇－16與ZW12混合接種時，隨著ZW12在菌種中比例的上升，α-淀粉酶和酸性蛋白酶的酶活呈顯著上升趨勢，表明菌株ZW12產α-淀粉酶和酸性蛋白酶能力較強，在米曲霉蘇－16與GC3混合接種時，隨著米曲霉蘇－16在菌種中比例的上升，糖化酶酶活呈顯著上升趨勢，表明米曲霉蘇－16產糖化酶較強，米曲霉蘇－16與GC3混合接種相對于與ZW12混合接種，糖化酶酶活整體偏高，酸性蛋白酶整體偏低，表明菌株GC3產酸性蛋白酶很弱，這與徐成勇等人的研究結果相一致［16］。綜合考慮，選定米曲霉蘇－16與ZW12混合為制曲菌種，混合比例為1∶2。

圖3 不同菌株不同比例混合接種酶活比較

2.4 單因素實驗結果

單因素實驗設計中，接種量分別取1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL，培養時間取 24，28，32，36，42，48，52 h，原料含水量取 45%，50%，60%，70%，80%，90%，試驗結果表明最佳培養條件分別為:接種量3.0 mL/50 g原料，培養時間48h，原料含水量80%。

2.5 響應面實驗結果

按中心組合設計確定的方案進行制曲實驗，具體實驗方案以及制曲中糖化酶、α-淀粉酶和酸性蛋白酶活測定結果如表4所示。

表4 CCD設計表及實驗結果

2.5.1 制曲各因素對響應值糖化酶酶活的影響

對中心組合實驗設計以糖化酶為響應值進行方差分析和回歸分析，對各個變量的回歸系數和整個模型方程進行顯著性檢驗，具體分析結果見表5。

表5 中心組合設計對糖化酶分析結果

實驗結果表明，A(接種量)，B(培養時間)，C(原料含水量)對糖化酶活影響顯著。回歸模型的P值＜0.000 1，表明模型極顯著，對回歸系數進行顯著性檢驗，模型變量 B，C，AB，AC，BC，C2高度顯著;A，B2也較顯著，一次項，二次項都有顯著性因素，因此各實驗因子對響應值糖化酶的影響不是簡單的線性關系。

二次方程的擬合度可由決定系數R2、相關系數R、變異系數CV或者F值來反映。一個具有較好擬合度的二次方程模型，其R2至少為0.8［17］。通常CV值反映模型的置信度，即CV值越低模型的置信度越高。根據Jogleker的研究［18］，模型的 CV值在10以內時，就意味著其置信度較高。僅考慮顯著項，制曲過程中各因素對糖化酶的影響可以通過以下多元回歸方程進行描述:

糖化酶酶活=1067.18－29.74×A－50.76×B－111.75×C－138.30×AB+56.15×AC－55.78×BC－28.95×B2－58.93×C2

經F值檢驗顯示模型方程高度顯著(P＜0.01)，模型的決定系數R2=96.30%，校正擬合度R2(Adj)=92.96%，變異系數CV值為4.27，失擬項不顯著，說明模型方程能夠很好地反映真實的實驗數據。應用響應面分析法，找出了響應變量(糖化酶活)的穩定點，穩定點不是最高值，只是一個鞍點。

2.5.2 制曲各因素對響應值α-淀粉酶的影響

用同樣的方法對中心組合實驗設計以α-淀粉酶酶活為響應值進行方差分析和回歸分析，對各個變量的回歸系數和整個模型方程進行顯著性檢驗，模型的P＜0.000 1，說明試驗所選用的二次多項模型的模擬度極高。模型中參數 A，C，AB，AC，B2顯著，失擬項的P值為0.085 8，無顯著意義，說明實驗數據中無異常點，無需引入更高次項，模型可行。另外，模型的決定系數 R2=94.48%，校正擬合度 R2(Adj)=89.52%，變異系數CV值2.14，表明該模型可以很好地反映真實的實驗數據。

僅考慮顯著項，制曲過程中各因素對α-淀粉酶的影響可以通過以下多元回歸方程進行描述:

α-淀粉酶酶活 =13.05－0.21×A+0.35×C+0.79×AB－0.24×AC－0.58×B2

應用響應面分析法，找出了響應變量(α-淀粉酶活)的穩定點，穩定點也是一個鞍點。

2.5.3 制曲各因素對響應值酸性蛋白酶的影響

同樣對中心組合實驗設計以酸性蛋白酶酶活為響應值進行方差分析和回歸分析，對各個變量的回歸系數和整個模型方程進行顯著性檢驗，模型的P＜0.000 1，說明試驗所選用的二次多項模型高度顯著。模型中變量 C，AB，BC，A2，C2，B2顯著，失擬項不顯著，說明實驗數據中無異常點，無需引入更高次項，模型可行。模型的決定系數R2=99.20%，校正擬合度R2(Adj)=98.48%，變異系數CV值2.03，符合建立模型的各項標準，所以該模型可以用于解釋實驗設計及結果。

僅考慮顯著項，制曲過程中各因素對酸性蛋白酶的影響可以通過以下多元回歸方程進行描述:

酸性蛋白酶酶活=344.51+21.81×C+13.86×AB－19.0×BC－27.39×A2－37.02×B2－20.51×C2

應用響應面分析法找出了響應變量(酸性蛋白酶酶活)的穩定點，此穩定點為最大值。按照得到的數學模型繪制響應曲面圖，見圖3～圖5。

圖3 培養時間與接種量的交互作用

圖3～圖5直觀地給出了各個因子交互作用的響應面和等值線分析圖。從響應面的最高點和等值線可以看出，在所選范圍類存在極值，既是響應面的最高點，同時也是等值線最小橢圓的中心點。從圖中可以直觀地看出，接種量、培養時間、原料含水量對酶活都有影響，特別是培養時間與接種量的交互作用影響較大，在響應曲面圖中表現為曲面坡度大，變化明顯。

圖4 原料含水量與接種量的交互作用

圖5 培養時間與原料含水量的交互作用

結合回歸模型的數學分析可知，制曲最優工藝參數為，接種量2.75 mL/50 g原料，培養時間47.21 h，原料含水量81.01%，此工藝條件下3種酶活理論值分別為糖化酶1 063.1 U/g，α-淀粉酶13.3 U/g，酸性蛋白酶341.5 U/g。

2.5.4 最佳工藝條件的驗證

在該模型的最優點處做3次平行試驗驗證，得到3種主要酶活平均值分別為:糖化酶1 075.4 U/g，α-淀粉酶12.3 U/g，酸性蛋白酶346.7 U/g。可見，基于響應面分析法得到的優化參數準確可靠，具有實際應用價值。

3 結論

(1)對從酒廠分離得到的真菌進行篩選，得到產淀粉酶菌株15株，產蛋白酶菌株13株，其中部分菌株既能產淀粉酶也能產蛋白酶，此研究結果進一步證實，黃酒麥曲的主要水解酶類來源于微生物。

(2)進一步試驗表明:米曲霉蘇－16與ZW12以1∶2的比例接種時，效果最好。混合菌種最優制曲條件為:培養時間47.21 h，原料含水量81.01%，接種量2.75 mL/50 g原料，培養溫度30℃。通過組合雙菌株制曲，較傳統的米曲霉蘇－16單菌種制曲，提高了主要水解酶類的酶活，改善了傳統熟麥曲酶系組成，混合菌種制得麥曲的糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶的酶活較傳統熟麥曲分別提高了3.5%、77.3%、59.7%。有關這一制曲條件下的成曲對黃酒釀造結果如淀粉及蛋白質利用率、產品風味、黃酒主要成分如總氮、總酸、糖分等的影響，將做進一步的研究。

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