兒童門靜脈海綿樣變性脾靜脈中NF-κB、VEGF的表達(dá)及意義

毛建雄 劉磊 王斌 王建堯 羅燕 康星鈺

門靜脈海綿樣變性(cavernous transfromation of portal vein，CTPV)是兒童比較少見的疾病，但近年來隨著影像學(xué)診斷技術(shù)的進(jìn)步，診斷率逐漸提高。門靜脈海綿樣變性患兒肝功能多無異常，主要表現(xiàn)為肝前性門靜脈高壓，消化道出血是其主要的癥狀及死亡原因，脾臟增大及脾功能亢進(jìn)是本病的特征之一。本研究通過測定患者脾臟中NF-KB及VEGF的表達(dá)探討CTPV患者脾臟增大的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 取2000年2月至2007年3月期間確診門靜脈海綿樣變性并行分流術(shù)患者脾靜脈石蠟切片7例作為實(shí)驗(yàn)組;對照組取車禍傷脾挫裂傷行脾切除患者脾靜脈石蠟切片8例，脾切除前無脾臟方面的病變。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 兔多抗 NF-κBp65抗體，鼠單抗 VEGF(IgG)抗體，兔超敏二步法免疫組化試劑盒，鼠超敏二步法免疫組化試劑盒，濃縮型DAB試劑盒，均購自北京中杉金橋公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 石蠟切片機(jī) LEICA RM 2135(Leica公司)，顯微鏡 DMLB-30(Leica公司)，顯微鏡成像系統(tǒng)(高通公司)，隔水式恒溫培養(yǎng)箱 GNP-9160(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，電子干燥箱 LG050B，APES載玻片(北京中杉金橋公司)，微波爐(Panasonic)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 免疫組化步驟 石蠟切片脫蠟至水，PBS沖洗，浸泡于含3%H2O2去離子水10 min，將切片放入枸櫞酸鹽緩沖液中，微波爐內(nèi)加熱，使容器內(nèi)液體溫度達(dá)到在92℃ ～98℃之間并維持10～15 min。取出容器，室溫中冷卻10～20 min。PBS沖洗，滴加VEGF(或NF-κBp651:100)一抗抗體，于濕盒內(nèi)4℃過夜孵育。PBS沖洗，分別滴加試劑1，室溫孵育20 min，PBS沖洗，滴加試劑 2，室溫孵育 20 min，PBS沖洗，用DAB顯色，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，自來水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染，約2 min，自來水充分洗滌，浸于1%鹽酸酒精分化，自來水充分洗滌。70%、80%、90%酒精脫水;無水酒精I(xiàn)、無水酒精Ⅱ脫水。二甲苯I、二甲苯Ⅱ透明，中性樹膠封片。

1.4.2 NF-κB及VEGF結(jié)果判定 于400倍高倍光鏡下進(jìn)行判定，NF-κB陽性顆粒位于細(xì)胞核或細(xì)胞漿，為棕黃色染色，VEGF陽性顆粒位于細(xì)胞漿，為棕黃色染色。

NF-kappa Bp65表達(dá)的測定:由于NF-КB活化后進(jìn)入細(xì)胞核，因此單純測量胞漿或胞核光密度不能完全代表NF-КB的活性，因此我們采取核漿光密度比值代表NF-КB的表達(dá)。每張切片隨機(jī)取100個(gè)細(xì)胞，用Image Pro Plus 6.0醫(yī)學(xué)圖像分析軟件對每個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞漿光密度值(OD)進(jìn)行分析，計(jì)算核漿光密度比值，取均值來表示激活的NF-κB的相對表達(dá)量［1］。

VEGF表達(dá)的測定:用 Image Pro Plus 6.0醫(yī)學(xué)圖像分析軟件分別檢測每張切片的5個(gè)視野中陽性染色部位的積分光密度(IOD)值，及測量區(qū)域的面積(取出血管腔面積)，計(jì)算出平均光密度(mean density)，并取平均值來表示VEGF的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS V 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以±s表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NF-κB的表達(dá) 對照組陽性顆粒少，主要位于胞漿，染色較淺;實(shí)驗(yàn)組陽性顆粒較多，胞漿與胞核均有染色。免疫組化半定量測定實(shí)驗(yàn)組NF-κB的表達(dá)高于對照組，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表1。

2.2 VEGF的表達(dá) 陽性顆粒位于胞漿，實(shí)驗(yàn)組與對照組均有表達(dá)，但實(shí)驗(yàn)組的陽性細(xì)胞明顯較對照組多，半定量測定實(shí)驗(yàn)組VEGF的表達(dá)高于對照組，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表2。

表1 實(shí)驗(yàn)組與對照組脾靜脈NF-κB表達(dá)的對比

表2 實(shí)驗(yàn)組與對照組VEGF表達(dá)的對比

3 討論

門靜脈海綿樣變性(cavernous transfromation of portal vein，CTPV)是指由不同病因致門靜脈主干和(或)分支完全或部分阻塞或閉塞后，在其周圍形成的大量的細(xì)小靜脈，形成向肝性的側(cè)支循環(huán)，表現(xiàn)為多腔隙的海綿樣的病理改變，屬于肝前型門靜脈高壓［2］。主要表現(xiàn)為門靜脈高壓癥和繼發(fā)的食管胃底靜脈曲張破裂和(或)伴有門靜脈高壓性胃病。多有典型Banti綜合征的表現(xiàn):貧血、上消化道出血、脾腫大，其次為腹痛、發(fā)熱。嘔吐多為首發(fā)癥狀，患者可反復(fù)嘔血和柏油便，出血量大時(shí)出現(xiàn)失血性休克，伴有輕到中度的脾大、脾功能亢進(jìn)。門靜脈海綿樣變分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種，前者是由于門靜脈主干和它的屬支先天性發(fā)育異常所致，后者多發(fā)生于急性栓塞后［3］。目前其發(fā)病機(jī)制尚不明了，Gibson等［4］認(rèn)為可能是由于門靜脈海綿樣血管瘤樣變、胚胎發(fā)育過程中門靜脈畸變，或門靜脈后天性疾病如新生兒臍靜脈炎、門靜脈附近腫瘤、創(chuàng)傷等所致。

門靜脈壓力的升高可導(dǎo)致內(nèi)臟器官血管發(fā)生病變，血管病變的病理改變包括內(nèi)臟靜脈的動脈化構(gòu)形改建內(nèi)臟靜脈的內(nèi)膜損傷以及內(nèi)臟動脈壁收縮結(jié)構(gòu)的破壞，如出現(xiàn)門靜脈血管壁結(jié)構(gòu)變化，脾臟增大，腸系膜血管迂曲，胃腸道淤血等。門脈高壓性血管病變的發(fā)病機(jī)制可能與門脈系統(tǒng)的血流動力學(xué)改變、免疫反應(yīng)、基因調(diào)控、血管活性物質(zhì)等因素有關(guān)［5］。目前已有研究表明NF-κB參與門靜脈高壓血管病變的發(fā)病過程。Andrea J等［6］研究發(fā)現(xiàn)在門靜脈部分結(jié)扎大鼠胃黏膜NF-κB 表達(dá)是增強(qiáng)的，Hailing Liu 等［7］認(rèn)為 NF-КB 作為一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在門脈高壓血管病變中發(fā)揮作用。

NF-κB作為一種核轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控多種下位基因，在已發(fā)現(xiàn)的參與血管生成的因子中，已證明VEGF，IL-1a，IL-8，VCAM-1，TNF-α等基因中含有NF-κB的特異性結(jié)合位點(diǎn)，這些血管生成因子也是NF-κB的下位基因，NF-κB可以調(diào)控這些基因的表達(dá)［8］。本研究中實(shí)驗(yàn)組脾靜脈血管壁NF-КB、VEGF的表達(dá)明顯高于實(shí)驗(yàn)組，提示NF-КB、VEGF可能參與CTPV患兒脾臟血管改建及血管的新生，可能為門靜脈高壓脾臟增大及脾功亢進(jìn)的發(fā)病機(jī)制之一。

近年，門靜脈高壓血管病變的研究逐漸深入，由于NFКB、VEGF在門靜脈高壓血管病變中所表現(xiàn)出的特異性促血管生成及血管改建作用，使其存在廣泛的研究前景。通過抑制NF-КB、VEGF活性來抑制血管生成及改建，作為一種新的治療門靜脈高壓的方法正在被應(yīng)用于臨床［9］。但由于NFКB、VEGF在CTPV發(fā)病機(jī)制尚不清楚，且NF-КB、VEGF在治療門靜脈高壓的療效尚不親切，因此，雖然NF-КB、VEGF對治療CTPV血管病變具有廣闊的前景，但仍需要進(jìn)行大量的研究。

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