乳酸菌的分離與篩選試驗

2012-11-20 10:26:22王靜山東省單縣畜牧局273700

山東畜牧獸醫 2012年9期

王靜（山東省單縣畜牧局 273700）

乳酸菌的分離與篩選試驗

王靜（山東省單縣畜牧局 273700）

本試驗對復篩得到的3個乳酸菌菌株LS-3、LS-9、LS-15進行抑菌效果、耐藥性和產酸能力試驗。結果表明，3種乳酸菌對有害微生物有拮抗作用，耐酸性強，有較強的存活力，受抗生素藥物的干擾小，無毒無副作用，具有較好的應用前景。

乳酸菌腹瀉篩選

乳酸菌是腸道的正常菌群之一，它對腸道內多種微生物群落有一定調整作用，作為益生素菌種在腸道內生長繁殖，改善腸道環境，尤其在預防和治療由大腸桿菌等引起的獸禽腹瀉等消化系統疾病，具有較好的作用，從而提高獸禽的成活率，并可促進獸禽生長。本研究中通過不同的實驗篩選，試驗結果如下。

1 材料與方法

1.1 供試培養基

1.1.1 分離培養基 BCP培養基：酵母膏2.5g、蛋白胨5g、葡萄糖5g、溴甲酚紫0.04g、瓊脂15g、蒸餾水1000ml，pH6.8~7.0。淘米水液體培養基：糯米:水=1:2，浸泡3d后，過濾，滅菌后備用。

1.1.2 產酸培養基葡萄糖10g、MgSO4·7H2O 1g、蛋白胨2g、酵母膏5g、NaCl 1g、蒸餾水1000ml、pH7.0~8。

1.1.3 鑒別培養基形態觀察用BCP平板培養基。糖的氧化和發酵培養基：蛋白胨1.0g、NH4H2PO41.0g、KCl 0.2g、 MgSO4·7H2O 0.2g、溴百里酚藍(1.6%酒精溶液)1.5ml、瓊脂3.0g、蒸餾水1000.0ml。

1.2 菌種的分離與純化

1.2.1 標樣的來源新鮮豬結腸內容物、活雞腸道內容物置入無菌生理鹽水稀釋，吸取5ml置入95ml富集培養基厭氧培養48h，如此連續5次進行的富集培養液備用；新鮮西紅柿在無菌淘米水液體培養基中厭氧富集培養48h，如此連續3次進行的富集培養液備用的培養液備用。

1.2.2 菌株的分離將不同的標樣溶液分別系列稀釋，涂布于BCP平板上，挑取有透明圈的菌落，反復純化至純種挑至牛奶試管中保存。

1.2.3 初篩將分離得到的純化菌株接種于液體產酸培養基中，37℃厭氧培養48h，用標定的0.01N氫氧化鈉溶液滴定，挑選相對產酸量高的菌株。

1.2.4 復篩以弱毒型大腸桿菌(E. coli)作為試驗菌，將初篩菌種的發酵液離心后，取上清液用杯蝶法測其抑菌活性，保留具有抑菌活性的菌株。

1.2.5 乳酸菌鑒定據伯杰氏細菌鑒定手冊對乳酸菌的描述，將篩選確定的G+菌株進行接觸酶試驗和菌懸液接種于糖發酵培養基試管中，觀察反應結果。并用從中國農業微生物菌種保藏管理中心購買的標準菌株Accc10644(植物乳桿菌)，Accc10637(嗜酸乳桿菌)，Accc10180(糞鏈球菌)作對照。

1.2.6 抑菌譜的測定分別以革蘭氏陰性菌弱毒型豬霍亂沙門氏菌（Salmonella C500）、強毒型雞白痢沙門氏菌（Salmonella C79-13），革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），單核細胞增生利斯特氏菌（Listera monocytogenes 54002），熱帶產朊假絲酵母和啤酒酵母（Saccharomaces cerevisiae）作為試驗菌，用管碟法測定復篩確定的菌株對上述供試菌株的抑菌作用。

1.2.7 抗藥性的測定采用牛津杯法。預先將復篩確定的菌株分別涂BCP平板，牛津杯置于平板上。分別取土霉素、PPA、黃連素（濃度均為800IU/ml）、青霉素鈉鹽(濃度為1000IU/ml)0.2 ml置于牛津杯中。

2 結果與分析

2.1 菌種的確定

從不同來源材料中，共分離得到純培養菌株56株。其中G染色結果為陽性、KOH試、H2O2酶試驗、明膠水解試驗、產硫化氫試驗均為為陰性的有29株，確定為乳酸菌，將其編號從LS-1到LS-29。

2.2 菌株的篩選

通過產酸能力的檢定和對豬源弱毒型大腸桿菌有抑制效果的比較，LS-3、LS-9、LS-15三個菌株產酸能力較強，對E. coli的抑菌圈的直徑(mm)分別為：18.2±2、15.8 ±1、19.3±2.3。因此，選擇其中抑菌活性較強的3個菌株作為進一步研究材料。

2.3 復篩菌株的鑒定

生化試驗結果見表1。

表1 生化微量管鑒定結果表

由表1可以判斷，所篩選出的3株菌株均為乳酸菌，其中，LS-3為嗜酸乳桿菌，LS-15為植物乳桿菌，LS-9為乳酸球菌。

2.4 抑菌譜測定

復篩出的3株菌株對供試菌株的抑制作用見表2。

表2 不同菌株抑菌效果(抑菌圈直徑) (mm)

由表2可以看出，3個菌株對所供試的禽畜上常見的腐敗菌和病原菌均具有明顯的抑制作用，這其中包括G+的金黃色葡萄球菌、單核細胞增生利斯特氏菌及G-豬霍亂沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌均有較好的抑制作用，其中乳酸球菌的作用又略好于兩乳酸桿菌。同時，三個菌株對熱帶產朊假絲酵母、啤酒酵母又均表現出無抑制作用。因此，可將同樣具有益生素效果的熱帶產朊假絲酵母、啤酒酵母添加進去，進行多菌株混合培養，以達最大產量。