濰坊地區奶牛隱性乳房炎主要病原菌的分離鑒定

張廣斌 （山東畜牧獸醫職業學院 山東 濰坊 261061）

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濰坊地區奶牛隱性乳房炎主要病原菌的分離鑒定

張廣斌 （山東畜牧獸醫職業學院 山東 濰坊 261061）

本研究選取山東省濰坊市某奶牛場對隱性乳房炎最常見的病原菌金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和大腸桿菌進行分離鑒定和數據統計，三種病原菌在該場的檢出率分別為27.88%、11.54%和7.69%，在隨后對其他七個奶牛場的部分乳樣的細菌分離結果中證明，該三種病原菌在濰坊地區奶牛隱性乳房炎乳汁中廣泛存在。

隱性乳房炎 病原菌 分離鑒定

極大多數乳房炎是由病原菌感染引起。從乳房中分離到130種引起乳房炎的病原微生物，其中包括細菌、真菌、病毒、支原體等。各種病原微生物的感染，因地區以及管理狀況的不同而異。臨床上主要以病原細菌感染為主。其中金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、大腸桿菌為奶牛隱性乳房炎牛乳中分離的最主要的細菌。

金黃色葡萄球菌是隱性乳房炎最主要的病原，而且還可以引起臨床型、膿毒性乳房炎，已成為某些牛場或牛群中的主要問題。劉文進等通過對新疆北疆地區泌乳奶牛隨機抽樣調查表明，葡萄球菌的檢出率為90%以上，其中，金色葡萄球菌占70%~80%。金葡菌存在于感染乳房內，同時可以寄生于乳頭皮膚、乳頭口、扁桃體、陰道和全身皮膚上等，但乳頭皮膚上最多，特別在乳頭發生創傷時最易生長繁殖。此菌主要來自感染部位的分泌物經擠奶工的手、機器擠奶杯或如同抹布等，通過乳頭口感染于乳腺內。

無乳鏈球菌為鏈球菌中危害最大、最常見、具有高度傳染性的一種病原菌，是感染乳區經乳汁大量排出的細菌。該鏈球菌主要在擠奶時通過乳頭口傳給非感染乳區乳腺內，若不采取有效措施，無乳鏈球菌可在牛群中迅速擴散蔓延。被無乳鏈球菌感染的乳區體細胞數很高，有時奶超過100萬個/ml。奶中的細菌含量往往也很高。為防治無乳鏈球菌，在擠奶時應注意衛生，特別要強調在擠奶后用消毒劑藥浴乳頭，可明顯抑制該病菌的傳播。

大腸桿菌類細菌為環境性菌，與奶牛乳房炎最密切的有大腸桿菌、克雷伯氏菌，此菌存在與糞便、污水、被污染的墊料中，在奶牛環境中普遍存在。

奶牛隱性乳房炎最可靠的診斷方法是對某頭奶牛的牛奶做細菌分離培養以便鑒定細菌種類，并確定選用最適合的抗菌素治療。本研究選取山東濰坊某奶牛場隱性乳房炎陽性的83頭奶牛作為研究對象，對乳樣中的金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和大腸桿菌三種主要病原菌進行分離和鑒定，并對三種病原菌在該地區隱性乳房炎的存在情況進行存在性調查。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗奶牛 某奶牛場LMT檢測陽性奶牛83頭，其它各場隨機選取非臨床型乳房炎泌乳牛奶牛各10頭。

1.1.2 各種培養基 （1）分離用培養基。肉湯：含10%血清，用于增菌培養和鑒定細菌的輔助培養基。鮮血瓊脂平板和斜面：含3%羊鮮血，用于營養需求比較高的細菌的分離培養、鏈球菌的溶血現象觀察和CAMP試驗，以及菌種的保存。改良愛德華瓊脂平板：含醋酸鉈和結晶紫，用于鏈球菌的選擇培養和鑒別。卻甫曼瓊脂平板：含7.5%NaCl，用于葡萄球菌的選擇培養和鑒別。麥康凱瓊脂平板：用于腸道桿菌的選擇培養和鑒別。（2）鑒別用生化反應培養基。糖發酵管、0.1%馬栗苷、1%馬尿酸鈉、0.1%美藍脫脂奶、6.5%NaCl、pH9.6肉湯、40%牛膽汁瓊脂、半固體甘露醇、石蕊牛奶、O/F(氧化/發酵)瓊脂、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸櫞酸鹽瓊脂斜面、尿素瓊脂斜面、三糖鐵瓊脂斜面、半固體瓊脂、明膠、兔血漿等。（3）LMT診斷液。購自中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳樣采集 擠奶前用40℃左右0.02%~0.03%高錳酸鉀溫水溶液消毒手指，毛巾消毒后擰干備用。用消毒濕毛巾擦拭乳頭和乳房。按摩乳房，將擠出的頭2~3把奶棄掉。LMT檢測。然后70%酒精棉球消毒乳頭和采樣人員的手指，無菌操作采集經LMT檢測陽性乳區乳樣5~10ml，注入滅菌試管中，標明牛號、乳區、日期等，送4℃冰箱保存，并盡快做細菌分離。

1.2.2 常見病原菌分離 分別將乳樣接種到：改良愛德華瓊脂平板、卻甫曼瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、營養肉湯等培養基，將接種好的培養基置于37℃恒溫箱中培養18~24h，觀察細菌生長情況。并根據細菌分離情況對常見病原菌進行鑒定。（1）金黃色葡萄球菌的分離鑒定。在卻甫曼瓊脂平板上直徑約1.5~2mm、呈金黃色的菌落，懷疑為金黃色葡萄球菌，挑取單個菌落接種鮮血瓊脂平板，經37℃培養18~24h后，挑取鮮血瓊脂平板上形成β-溶血的菌落進行涂片和革蘭氏染色，油鏡檢查。如菌落不均一，或者鏡檢細菌菌體形態特征不均一，說明細菌不純粹，挑取單一菌落進行純化，并用同法進行染色鏡檢，直到得到細菌的純培養。然后進行如下生化試驗：有氧甘露醇發酵試驗、無氧甘露醇發酵試驗、兔血漿凝固酶試驗、O/F、過氧化氫酶試驗等，以鑒定其致病性。記錄金黃色葡萄球菌的陽性檢出率。（2）無乳鏈球菌的分離鑒定。在改良愛德華瓊脂平板上直徑約1~ 1.5mm、呈淺紫色、褐色或黑色的單個菌落，懷疑為鏈球菌，接種于鮮血瓊脂平板上，倒置于37℃恒溫箱中培養18~24h，觀察菌落溶血情況，并挑取上述各種菌落進行涂片和革蘭氏染色鏡檢，如菌落特征和菌體特征均一則進行生化鑒定，否則連續平板分離，直到獲得細菌的純培養物。用獲得的鏈球菌純培養物進行下列試驗：鏈球菌的CAMP試驗、馬栗苷發酵試驗等，以鑒定鏈球菌的群。記錄無乳鏈球菌的陽性檢出率。（3）大腸桿菌的分離鑒定。在麥康凱瓊脂平板上直徑約2~3mm、呈粉紅色不透明的菌落懷疑為大腸桿菌，挑取單個菌落接種于營養瓊脂平板，倒置于37℃恒溫箱中培養18~24h，觀察菌落特征，并進行涂片和革蘭氏染色，如菌落特征和菌體形態染色特征均勻一致，則進行生化鑒定，否則，連續平板分區劃線培養和形態染色鑒定，直到獲得細菌的純培養物，并進行下列生化試驗：葡萄糖發酵試驗、乳糖發酵試驗、麥芽糖發酵試驗、甘露醇發酵試驗、硫化氫試驗、尿素酶試驗、靛基質試驗、甲基紅試驗、V-P試驗、枸櫞酸鹽利用試驗、明膠液化試驗等，根據生化試驗結果做出鑒定。記錄大腸桿菌的陽性檢出率。

表1 金黃色葡萄球菌主要生化試驗特性

表2 無乳鏈球菌的主要生化特性

表3 大腸桿菌的主要生化特性

1.2.3 七個奶牛場的細菌分離鑒定 用相同的試驗方法對其他七個奶牛場中LMT檢測陽性的乳區各采集乳樣10份進行三種病原菌的分離和鑒定，記錄各病原菌的陽性檢出數。

2 試驗結果

2.1 細菌分離鑒定結果

經LMT檢測，檢出陽性牛83頭，陽性乳區141個。經細菌分離實驗，共有91份乳樣檢出細菌104株。乳樣細菌檢出率64.54%。經細菌生化實驗鑒定金黃色葡萄球菌29株、無乳鏈球菌12株、大腸桿菌8株，檢出率(分離鑒定株數/細菌分離總株數)分別為27.88%、11.51%和7.69%，三種病原菌的檢出率為47.08%。

表4 某奶牛場金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和大腸桿菌的檢出率

2.2 七個奶牛場的細菌分離鑒定結果

金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、大腸桿菌在其他七個奶牛場的檢出數見表5。

表5 七個奶牛場三種病原菌檢出份數

3 討論

通過對山東濰坊某奶牛場的三種主要病原菌的分離和鑒定，結果表明，金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和大腸桿菌在該場患隱性乳房炎的奶牛中普遍存在，且檢出率均較高，是引起該場隱性乳房炎的主要病原菌。通過對濰坊地區其他七個奶牛場隨機采集的各10份乳樣進行的金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和大腸桿菌的檢測，結果表明，三種主要病原菌在濰坊地區奶牛場隱性乳房炎乳樣中廣泛存在。

大量文獻表明，引起奶牛隱性乳房炎的主要病原菌為金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和大腸桿菌。有關山東省的研究資料證實了這一點。馬保臣等對山東濟南某規模化奶牛場隱性乳房炎乳樣病原菌檢查結果為細菌檢出率73.24%，葡萄球菌檢出率17.61%，鏈球菌檢出率11.97%，腸桿菌檢出率18.31%。郭龍宗等對煙臺地區某奶牛場細菌分離結果表明，頭細菌檢出率75%，乳區細菌檢出率69%，證實鏈球菌和葡萄球菌是引起該場隱性乳房炎的主要病原菌。賈玉萍等2004年對濟南5個奶牛場的147份隱性乳房炎乳樣進行了細菌分離鑒定，細菌檢出率68.03%，鑒定的細菌主要有葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌等。陳德等對青島某奶牛場隱性乳房炎乳樣分離鑒定出83株細菌，其中金黃色葡萄球菌13株，無乳鏈球菌11株，大腸桿菌6株，占細菌分離數的36%。王志遠等在青島某奶牛場的隱性乳房炎乳樣中分離出65株細菌，其中金黃色葡萄球菌21株(占32.31%)，無乳鏈球菌23株(占35.38%)，大腸桿菌7株(占10.77%)。

引起奶牛乳房炎的病原菌有多種，常見的也有20多種。各種病原微生物的感染，因地區以及管理狀況的不同而異。文獻對奶牛隱性乳房炎的細菌分離鑒定結果并不統一，有的相差較大。張曉菊等對金華市某奶牛場主要細菌的分離鑒定結果表明，該場奶牛隱性乳房炎的主要病原菌為凝固酶陰性葡萄球菌，占51%；大腸桿菌未檢出，據分析與該場飼養管理水平較高、綜合防治措施實施較好有關。

本試驗只對引起濰坊地區隱性乳房炎的三種主要病原菌進行了分離鑒定，三種病原菌的檢出率只有47.08%，各奶牛場的主要致病菌是否一致，本地區是否存在其他主要病原菌有待進一步研究。

[1] 吳國娟, 蔣林樹. 無公害奶牛養殖技術與疾病防治[M]. 北京: 中國農業科學技術出版社, 2002.

[2] 揚章平, 王健等. 奶牛隱性乳房炎的發病規律的研究[J]. 中國奶牛, 1998(1): 18-21.

[3] 董德寬, 陸靜等. 關于牛乳中的體細胞[J]. 乳業科學與技術, 2002, 100(3): 18-23.

[4] 董德寬, 王文光.乳牛高效生產技術手冊[M]. 上海: 上海科學技術出版社, 2004.

[5] 馬保臣, 李建基, 王春璈. 奶牛急性乳腺炎病原菌的分離與鑒定[J]. 中國獸醫雜志, 2004, 40(11): 22-24.

[6] 杜雅楠, 史春云, 張建華. 奶牛隱性乳房炎的調查分析[J]. 防檢技術, 2005(6): 29.

[7] 袁永隆, 張永欣, 侯新昭等. 奶牛乳房炎乳汁細菌的分離和鑒定程序[J]. 中國獸醫科技, 1991, 21(2): 7-10.

[8] 郭小雅, 束婧婷, 楊章平等. 奶牛隱性乳房炎發生規律的調查分析[J]. 中國獸醫雜志, 2005, 41(3): 23-25.

[9] 袁永隆, 張禮華, 劉純傳等. 我國奶牛乳房炎常見病原菌的區系調查[J]. 中國農業科學, 1992, 25(4): 70-76.

[10] 錢學智, 徐巧琴. 乳牛臨床型乳房炎的病原分離及鑒定[J]. 動物科學與動物醫學, 2002, 19(12): 29-31.

[11] 肖定漢. 奶牛病學[M]. 北京: 中國農業大學出版社, 2002.

[12] 李健強, 李六金. 獸醫微生物學實驗實習指導[M]. 西安: 陜西科學技術出版社, 1999.

[13] 威廉·C·雷布漢(美). 奶牛疾病學[M]. 趙德明, 沈建忠譯. 北京: 中國農業大學出版社, 1999.

[14] 方維煥, 胡松華, 劉漢儒. 奶牛隱性乳房炎病原菌及流行情況[J]. 中國獸醫科技, 1991(12): 6.

[15] 陳慧珍. 奶牛隱性乳房炎的診斷研究[J]. 浙江農業大學學報, 1984(3): 253.

[16] 劉文進, 陳創夫, 滕文軍等. 患隱性乳房炎的奶牛乳汁pH值變化與體細胞關系的研究[J]. 家畜生態學報, 2005, 26(3): 63-67.

[17] 郭龍宗, 張培興, 祝永華等. 奶牛場隱性乳房炎病原學研究[J]. 山東畜牧獸醫, 2006(1): 3-6.

[18] 賈玉萍, 萬仁忠, 寧召峰等. 奶牛乳房炎的病原菌分離鑒定與藥物敏感性試驗[J]. 中國畜牧獸醫, 2004(10): 35.

[19] 陳德, 魏太亮, 石清來. 奶牛隱性乳房炎病原菌的分離與耐藥性分析[J]. 中國動物檢疫, 2006, 23(2): 36.

[20] 張曉菊, 姜正前, 麻延峰等. 金華市奶牛隱性乳房炎病原菌分離鑒定與藥敏試驗[J]. 中國奶牛, 2006(1): 34-37.

[21] 王志遠, 宋冶萍. 青島市奶牛乳房炎的病原分離鑒定[J]. 畜牧與獸醫, 2002, 34(7): 31.

（2012–04–17）

S823.9+1

A

1007-1733(2012)09-0001-03