lgr5啟動子甲基化在上皮性卵巢癌中的表達及臨床意義

費 夢

(荊州市第二人民醫院婦產科，湖北 荊州 434000)

張傳宏

(荊州市第二人民醫院MRI室，湖北 荊州 434000)

lgr5啟動子甲基化在上皮性卵巢癌中的表達及臨床意義

費 夢

(荊州市第二人民醫院婦產科，湖北 荊州 434000)

張傳宏

(荊州市第二人民醫院MRI室，湖北 荊州 434000)

目的：探討lgr5甲基化與人類卵巢癌臨床病理之間的聯系，以及其作為判定總的生存率的價值。 方法：采用甲基化特異性聚合酶鏈式反應(methylation specific polymerase chain reaction，MSP)方法分析卵巢癌患者石蠟組織中lgr5啟動子DNA甲基化情況。 結果：lgr5在正常卵巢組織中幾乎無甲基化改變，而在良性卵巢腫瘤中頻率升高，上皮性卵巢癌組織中甲基化頻率明顯升高(P<0.01)；lgr5甲基化與低分化上皮性卵巢癌 (P<0.01)、腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ(P<0.05)以及淋巴結轉移(P<0.01)相關，但與組織類型關系不明顯(P>0.05)。在70例上皮性卵巢癌患者組織中，lgr5甲基化頻率為62.9%(44/70)，并且5年總的生存率明顯低于未甲基化的患者(P<0.05)。結論：lgr5甲基化與上皮性卵巢癌分化程度、腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ以及淋巴結轉移密切相關，同時也可以作為上皮性卵巢癌患者總的生存率的判定指標之一。

lgr5 甲基化；上皮性卵巢癌；總的生存率；甲基化特異性聚合酶鏈式反應(MSP)

卵巢癌是女性生殖系統常見的3種惡性腫瘤之一，因其早期臨床癥狀不明顯，起病隱匿，許多患者確診時已是晚期。卵巢癌分型中上皮性約占90%，手術和以鉑類為基礎的化療是上皮性卵巢癌的主要治療方式，但大部分患者癌細胞耐藥導致腫瘤復發，致使卵巢癌患者5年生存率不到30%[1-2]。因此，尋找卵巢癌致瘤基因以及治療靶點是阻止或根治卵巢癌的研究熱點。lgr5是近年來發現的一種致瘤基因，與卵巢癌、結腸癌、皮膚基底細胞癌以及肝細胞肝癌的發生發展都有著密切聯系[3-5]，特別是lgr5可以作為結腸癌和皮膚癌的腫瘤干細胞標志，并被認為是腫瘤的致瘤起源[6-7]。最近日益重視的腫瘤致瘤機制中DNA甲基化是一個重要的表觀修飾方式，致瘤基因的高甲基化通常會導致腫瘤的發生發展[8]。我們試圖通過檢測lgr5甲基化狀態改變，分析其甲基化與臨床病理之間的聯系，繼而分析甲基化對卵巢癌預后判定的意義。

1 對象與方法

1.1對象

選取荊州市第二人民醫院2000年到2006年間手術切除的卵巢石蠟組織標本。患者年齡27～82歲，平均49.75歲。所有標本經病理切片確診，其中上皮性卵巢癌70例，交界性卵巢癌25例，良性卵巢腫18例瘤和正常卵巢組織30例。上皮性卵巢癌中，漿液性囊腺癌35例，粘液性囊腺癌19例，卵巢子宮內膜樣腺癌11例，透明細胞癌5例；高分化15例，中分化22例，低分化33例；按照國際婦產科聯盟(FIGO)2000年制定的臨床手術病理分期標準，Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ45例；淋巴結轉移41例，未轉移29例。所有病例手術前均未進行放射治療及化學藥物治療。組織標本經過10%福爾馬林固定，石蠟包埋。70例上皮性卵巢癌納入隨訪病例，隨訪期限為60個月，無1例失訪。

1.2方法

1.2.1 石蠟標本中DNA提取和亞硫酸鹽修飾 用75%酒精擦拭切片刀、切片臺等，紫外線照射消毒30min，取3～5片10μm的石蠟切片置入干凈的1.5EP管。加入二甲苯1ml，室溫靜置15min，50℃孵育35min，70℃孵育5min。待液體清澈后，12000rpm，離心5min后，去掉上清，然后按照DNA提取試劑盒說明書操作(Qiagen)。操作完畢后，測定DNA濃度，取500ngDNA 按照DNA亞硫酸鹽修飾試劑盒操作(Zymo reseach)。

1.2.2 MSP及電泳 應用在線工具methyprimer分析lgr5啟動子序列，設計甲基化引物和未甲基化引物[9]，并提交上海英偉杰基公司合成。取2μl修飾后的DNA加入到12.5μl 熱啟動 premix (Takara)，MSP引物各1μl；USP引物各1μl，然后用DEPC水補充到25μl。MSP 引物序列為： CGGTAATCGGTATTTTTGTTTTC(上游)，TAAACTTCTACAACTCAACGAACGT(下游)；USP引物序列為： GGTGGTAATTGGTATTTTTGTTTTTT(上游)，AAACTTCTACAACTCAACAAACATC(下游)。模板以ddH2O為空白對照。反應條件為：95℃5min；95℃45s，60℃1min(MSP)/ 59℃1min(USP)，72℃50s，40個循環；72℃7min。反應結束后，取10μl產物在2%瓊脂糖膠電泳分析。

1.3統計學分析

實驗結果均采用SPSS13.0統計軟件分析，組間差異采用多個樣本率的χ2檢驗，總的生存率分析采用Kaplan-Meier分析，α=0.05。

2 結 果

2.1lgr5甲基化在各種卵巢組織中表達的變化

在正常卵巢組織檢測到1例甲基化，良性卵巢腫瘤檢測到2例(占11.1%)，在交界性囊腺瘤組織中甲基化8例(占32.0%)，在上皮性卵巢癌中甲基化44例(占62.9%)。在上皮性卵巢癌組織和卵巢交界性囊腺瘤組織中，lgr5甲基化頻率相對于正常卵巢組織和卵巢囊腺瘤組織中明顯升高，兩組之間比較有明顯統計學意義(χ2=39.372，P<0.01)。而上皮性卵巢癌組織與卵巢交界性囊腺瘤相比(χ2=7.079，P=0.008)，統計學上有顯著差異。結果說明，lgr5甲基化在卵巢組織癌變過程中逐步升高。

2.2lgr5與上皮性卵巢癌臨床病理之間的關系

表1 lgr5甲基化與上皮性卵巢癌臨床病理之間的關系

圖1 lgr5甲基化與未甲基化預測卵巢癌患者總的生存率

lgr5甲基化頻率在上皮性卵巢癌組織分型中改變無差異，漿液性囊腺癌中甲基化頻率為20/35，粘液性囊腺癌14/19，卵巢子宮內膜樣腺癌7/11，透明細胞癌3/5，組間差異無明顯統計學意義(χ2=1.485，P=0.476)。在上皮性卵巢癌中，低分化癌組織中lgr5甲基化頻率明顯高于高、中分化(χ2=11.655，P=0.003)；在Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌中，lgr5甲基化明顯增高，與Ⅰ～Ⅱ期相比有顯著差異(χ2=5.923，P=0.020)；并且lgr5高甲基化預示著淋巴結轉移(χ2=6.894，P=0.009)(見表1)。

2.3lgr5甲基化與卵巢癌總的生存預后的關系

在70例上皮性卵巢癌患者組織中，lgr5高甲基化患者約占62.9%(44/70)，與未甲基化的卵巢癌患者相比，5年生存率明顯降低(P=0.020)，lgr5甲基化患者的中位生存時間為44.8個月，而無甲基化的患者中位生存時間為53.5個月(見圖1)。

3 討 論

lgr5是一種獨立的G蛋白偶聯受體分子，屬于G蛋白偶聯激素受體家族一員，基因中包含了豐富色氨酸重復序列，也被稱作G蛋白偶聯受體49 (GPR49)[10]。與cyclinD1和c-myc類似，lgr5也被認為是受WNT信號途徑調節的靶基因之一。許多研究也證實lgr5在多種腫瘤中表達升高，如肝細胞癌、皮膚基底細胞癌等[3,5]。在結腸癌細胞中，采用siRNA干擾技術敲出lgr5會導致細胞凋亡,相反，過表達lgr5可以促進結腸腫瘤細胞增殖，增強細胞致瘤能力[1,2]。最近有研究表明lgr5可以作為結腸腫瘤干細胞的標志[11]。另外有研究也發現lgr5在卵巢癌組織高表達(53%)，并且與腫瘤Ⅲ～Ⅳ相關[4]。DNA甲基化被認為是腫瘤發生過程中一種非常重要的表觀修飾方式[8]。多種基因如BRAC1等在卵巢癌中高甲基化可以促進腫瘤發生和發展，并且與腫瘤的病理分期或轉移相關[12]。

在本研究中，我們采用lgr5啟動子區特異的甲基化引物分析lgr5在卵巢癌中的甲基化狀態，證實了lgr5甲基化從正常組織到上皮性卵巢癌過程中明顯升高，并且在良性腫瘤中也有少量改變，盡管統計學上沒有明顯差異，但這可以提示lgr5甲基化可能是癌變早期的一個分子信號。另外，我們也檢測了lgr5與上皮性卵巢癌臨床病理之間的聯系，結果發現，lgr5與腫瘤組織類型無關，但與腫瘤的分化、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ、淋巴結轉移有密切關系，從而證實了lgr5甲基化有助于判定腫瘤低分化，并且可以作為淋巴結轉移的一種分子標志。 我們進一步回顧性分析了lgr5甲基化與上皮卵巢癌患者5年總的生存率之間的聯系，發現在有lgr5甲基化的患者與無甲基化的患者比較而言，總的生存率明顯下降。由于我們所選樣本并不能代表整個卵巢癌患者群體，所以lgr5甲基化作為一種判斷預后生存指標的價值還需要進一步擴大樣本進行證實。

綜上所述，我們認為在卵巢癌組織中，lgr5啟動子區存在高甲基化狀態，并且與上皮性卵巢癌臨床分期Ⅲ～Ⅳ、低分化以及淋巴結轉移相關，同時也論證了lgr5甲基化可以作為判斷上皮性卵巢癌患者總的預后的一個指標。盡管如此，lgr5甲基化致瘤和調節轉移的機制還需要深入研究，以便為卵巢癌分子生物治療提供一個新的探索方向。

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[編輯] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.10.003

2012-09-02

湖北省衛生廳科研基金指導性項目(JX3C54)

費夢(1979-)，女，湖北荊州人，主治醫師，碩士，主要從事婦產科臨床與研究工作。

R737.31

A

1673-1409(2012)10-R006-03