不同電解質溶液對反膠束萃取花生蛋白的影響

孫秀平 陳 軍 陳鋒亮 王憲昌 李明華 趙曉燕

(山東省農業科學院農產品研究所，濟南 250100)

不同電解質溶液對反膠束萃取花生蛋白的影響

孫秀平 陳 軍 陳鋒亮 王憲昌 李明華 趙曉燕

(山東省農業科學院農產品研究所，濟南 250100)

研究了 KCl、NaCl、LiCl、MgCl2、NaNO3、KNO3、Na2SO4、MgSO48 種不同的電解質對 AOT/正己烷反膠束溶液萃取低溫花生粕中花生蛋白的影響，對反膠束的含水量、蛋白質的提取率及通過SDS－PAGE電泳試驗對蛋白質的亞基條帶進行了比較。試驗結果表明，電解質的種類會影響反膠束的含水量;陰離子與陽離子對反膠束溶液萃取大豆蛋白的前萃與后萃都有影響，電解質KCl和NaCl溶液所提取的蛋白質得率較高，分別為54.22%和50.19%;不同的電解質可以影響所得蛋白的亞基組成，可以用來分離不同的蛋白。

反膠束 電解質 花生蛋白 SDS－PAGE電泳

反膠束萃起源于20世紀70年代，本質上是一種液－液萃取，利用表面活性劑在有機相中形成反膠團，從而在有機相中形成分散的微水環境，使難溶于有機相或在有機相中發生生物活性變性的生物物質溶于其中的萃取技術，發展到現在已經有30多年的時間［1－2］，國內外眾多學者對其已經進行了廣泛研究。利用反膠束萃取蛋白質是瑞士科學家Luisi等［3］首次提出的。目前國內也有眾多研究者對反膠束萃取植物蛋白進行了研究。磨禮現［4］以低溫脫溶豆粕為原料對反膠束萃取過程進行了研究;陳復生等［5］、楊宏順等［6］利用反膠束技術同時萃取植物蛋白和植物油。

反膠束體系，是表面活性劑溶解在非極性有機溶劑中，當其濃度超過臨界濃度(CMC)時，在有機溶劑中形成的納米級聚集體［1，7］。反膠束萃取包括前萃(Forward Extraction)和后萃(Backward Extraction)兩個過程。當反膠束溶液與蛋白質水溶液或含蛋白質的固相接觸后，蛋白質可溶于反膠束的“水池”中，稱為前萃;將含有蛋白質的反膠束溶液與另一水相接觸，通過改變條件使蛋白質從反膠束轉移到水相中從而分離出蛋白質，稱為后萃［8］。反膠束配制過程中，加入不同的電解質會對反膠束的水池的大小等有影響，從而蛋白提取率及提取出來的蛋白質都會有所差異。

本試驗主要研究了反膠束溶液中加入不同的電解質提取花生蛋白，對蛋白質提取率及通過SDSPAGE電泳試驗對蛋白質的亞基條帶進行了比較，以期為反膠束萃取蛋白提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 原料和試劑

低溫花生粕:山東省高唐藍山集團。

AOT(丁二酸二異辛酯磺酸鈉)、正己烷、KCl、NaCl、LiCl、MgCl2、NaNO3、KNO3、Na2SO4、MgSO4:天津市富宇精細化工有限公司;卡爾費休試劑:天津賽孚瑞科技有限公司;試劑均為分析純。

1.2 儀器和設備

AFK－1B水分自動測定儀:上海禾工科學儀器有限公司;K9860凱式定氮儀:美國海能;PHSJ－3F pH計:上海精密科學儀器有限公司;JY－SCZ2+垂直電泳槽、JY300C電泳儀:北京君益東方電泳設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料花生粕成分分析

水分測定:GB 5009.3—2010;粗脂肪含量的測定:GB 5009.6—2003;粗蛋白的測定:GB 5009.5—2010;灰分的測定:GB 5009.4—2010;總糖的測定:3，5—二硝基水楊酸法;氮溶解指數(NSI)的測定:AACC方法46－23。

1.3.2 花生蛋白的提取工藝

AOT反膠束溶液配制:取適量的AOT加入到適量的正己烷中，超聲振蕩使其溶解使其濃度為0.08 g/mL，待溶液透明后中分別加入適量的濃度為0.05 mol/L KCl、NaCl、LiCl、MgCl2、NaNO3、KNO3、Na2SO4、MgSO4的 KH2PO4+Na2HPO4緩沖液(調節 pH 7.0)。圖1是反膠束萃取花生蛋白的工藝流程圖。

圖1 反膠束萃取分離花生蛋白的工藝流程圖

1.3.3 反膠束溶液中含水量的測定［9］

采用卡爾費休法測定反膠束溶液含水量。首先用卡爾費休試劑將甲醇中的水分滴去，然后向甲醇溶液中加入10 μL水，再用卡爾費休試劑滴定至終點，測定卡爾費休試劑的響應系數。

響應系數A=進樣水分的質量/消耗的卡爾費休試劑體積

準確量取50 μL的反膠束溶液，加入到甲醇溶液中，再用卡爾費休試劑滴定至終點，則反膠束溶液中所含水分質量為:

反膠束所含水分的質量=A×消耗的卡爾費休試劑體積

反膠束溶液含水量W0=反膠束溶液增溶水分的物質的量/反膠束溶液中表面活性劑的物質的量

1.3.4 蛋白萃取率的計算

分別取40 mL配制好的反膠束溶液，根據1.3.2的試驗結果分別加入 0.05 mol/L 的 KCl、NaCl、LiCl、MgCl2、NaNO3、KNO3、Na2SO4、MgSO4緩沖溶液，使各種反膠束溶液含水量W0值達到最大。然后加入一定量的低溫花生粕(精確到0.000 1 g)，在一定溫度的水浴恒溫振蕩器中振蕩一段時間，然后進行離心分離去除殘渣。利用凱氏定氮法測定前萃液中的蛋白質含量，計算蛋白前萃率。

蛋白前萃率=反膠束溶液中蛋白質的量/樣品中蛋白質的量×100%

向一定體積的前萃液中加入等體積的1 mol/L的 pH 7.0 的 KCl、NaCl、LiCl、MgCl2、NaNO3、KNO3、Na2SO4、MgSO4緩沖溶液，在一定溫度的水浴恒溫振蕩器中振蕩一段時間后離心，上層為含有油脂的有機相，下層為含有蛋白質的水相。利用凱氏定氮法測定后萃液中的蛋白含量，計算蛋白后萃率。

蛋白后萃率=水相中蛋白質的總量/前萃液中蛋白質的總量×100%

1.3.5 SDS － PAGE 電泳試驗［10］

取適量不同電解質的后萃液，4℃下透析24～48 h，通過SDS－PAGE電泳試驗鑒別花生蛋白亞基結構的變化。配制分離膠為15%，濃縮膠為4.5%;穩流法20 mA，染色20 min，脫色48 h以上。反膠束蛋白提取液上樣量分別是15 μL，用考馬斯亮藍染色，然后用脫色液進行脫色。

2 結果與分析

2.1 原料主要成分分析

原料主要成分分析結果如表1所示。

表1 原料主要成分含量

2.2 電解質種類對反膠束含水量的影響

圖2反映了不同電解質種類對AOT反膠束含水量的影響。從圖2中可以看出，對不同種類的電解質緩沖溶液，反膠團的含水量均呈現先增大后減小的趨勢。通常反膠束中表面活性劑的極性基團不是完全電離的，有很大一部分陽離子仍在膠團的內表面上，因此陽離子的種類會影響，該密度越大，產生的反膠束也越大［11］。因此對于不同的單價陽離子(Li+，Na+和K+)，由于其離子半徑不同(Li+﹤Na+﹤K+)而導致反膠束內表面的電荷密度不同，從而導致反膠束的大小不同，表現結果即為含水量不同。在沒有破環反膠束體系的前提下，加入相同體積的緩沖溶液，離子半徑越小，反膠束的含水量越大。通過對分別加入 NaCl、NaNO3、Na2SO4緩沖溶液，KCl、KNO3緩沖溶液和MgCl2、MgSO4緩沖溶液的3組對比發現，陰離子種類對反膠束含水量的影響較小。

圖2 電解質種類對反膠束含水量的影響

2.3 電解質溶液種類對AOT反膠束提取花生蛋白的影響研究

在AOT反膠束體系分別加入適量的KCl、NaCl、LiCl、MgCl2、NaNO3、KNO3、Na2SO4、MgSO4的 KH2PO4+Na2HPO4緩沖液(調節pH 7.0)，提取蛋白前萃率與后萃率的結果如圖3。

圖3 電解質種類對蛋白萃取率的影響

由圖3可以看出，電解質的種類不同將會引起反膠束中蛋白質的分布不同。在前萃液中，一價陽離子鹽類萃取率 KCl＞NaCl＞NaNO3＞KNO3＞Na2SO4＞LiCl和二價陽離子鹽類萃取率MgSO4＞MgCl2。相比較而言，總的趨勢是一價陽離子的鹽類提取率高于二價陽離子鹽類，這與Kinugasa等［12］研究其他的離子的試驗結論不一致。這可能是因為，對于不同種類的蛋白質電解質種類對其的影響不同［13］。在后萃液中，同樣呈現一價陽離子的鹽類提取率高于二價陽離子鹽類的規律，這與趙曉燕等［14］在不同電解質溶液對AOT反膠束溶液萃取大豆蛋白的影響研究中得出的結論一致。另外，陰離子的種類對蛋白后萃率也有一定的影響，NaCl＞NaNO3＞Na2SO4，可能是因為帶負電荷的蛋白質分子與NO3－、Cl－、SO42－發生了離子交換作用［15］，使蛋白質進入反膠束。KCl和NaCl所提取的蛋白質得率較高，分別為54.22%和50.19%，如果將前萃和后萃的工藝進一步優化，蛋白萃取率有可能進一步提高。

2.4 SDS－PAGE電泳試驗

圖4是在反膠束體系中加入不同的電解質溶液所提取的花生蛋白的SDS－PAGE電泳圖譜。由圖4中可以看出，不同的電解質溶液對所提取的花生蛋白的亞基組成有一定影響，這與Shiomori等［16］發現的在AOT反膠束中添加不同的鹽離子可提取不同種類的蛋白的結論一致。加入NaNO3和KNO3的反膠束溶液所提取的蛋白分子質量在18.4～45.0 ku附近的亞基較多，蛋白分子質量在45.0～66.2 ku附近沒有亞基，而加入KCl和NaCl的反膠束溶液所提取的蛋白分子質量在18.4～66.2 ku范圍內亞基都有所分布，這說明Cl－與NO3－相比更加有利于大分子蛋白的提取。與花生分離蛋白電泳圖相比較，加入KCl和NaCl所提取的蛋白亞基相似，這說明AOT反膠束中添加KCl和NaCl相對比較有利于花生蛋白的提取。

圖4 反膠束體系中加入不同電解質提取的花生蛋白的電泳譜圖

3 結論

3.1 卡爾費休法測定反膠束溶液含水量的試驗表明，加入不同的電解質會對反膠束的W0有影響，從而影響蛋白萃取率。

3.2 通過對反膠束中加入不同電解質提取花生蛋白的研究，得出各種不同的陰離子、陽離子由于離子半徑、電荷種類、電荷量的不同對蛋白的萃取過程有一定的影響，從而使得蛋白的前萃率和后萃率均有所不同。通過試驗可知，電解質KCl和NaCl溶液所提取的蛋白質得率較高，分別為54.22%和50.19%。

如果將前萃和后萃的工藝進一步優化，蛋白萃取率有可能進一步提高。

3.3 SDS－PAGE電泳試驗表明，反膠束中加入不同的電解質可以影響所得蛋白的亞基組成，可以用來分離不同的蛋白。

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Effect of Different Salt Solutions for Extraction of Peanut Protein in Reverse Micelles

Sun Xiuping Chen Jun Chen Fengliang Wang Xianchang Li Minghua Zhao Xiaoyan
(Institute Agro － Food Science and Technology，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Ji'nan 250100)

The review studied on effect of different salt solutions(KCl，NaCl，LiCl，MgCl2，NaNO3，KNO3，Na2SO4，MgSO4)for extraction of peanut protein in AOT/N －hexane reverse micelles from the low －temperature peanut meal，and compared with the W0of the reverse micelles and protein ratio.By SDS － PAGE electrophoresis experiment，compared with subunits of protein.The results showed that different salt solutions could cause the changes of W0.The anions and cations could affect the extraction of soybean protein in AOT reverse micelle.In salt solutions，the KCl and NaCl solutions in reverse micelles would benefit for protein extraction，the assignment of protein was 54.22%and 50.19%，respectively.The different salt solutions could cause the subunits of protein，which can be used to separate different kinds of protein.

reverse micelle，salt solution，peanut protein，SDS － PAGE

TS201.4

A

1003－0174(2012)09－0076－04

山東省科技發展計劃(2011GGC02044)，山東省優秀中青年科學家科研獎勵基金(BS2010NY027)

2011－12－01

孫秀平，女，1985年出生，碩士，農產品加工及貯藏工程

趙曉燕，女，1975年出生，副研究員，碩士生導師，食品理論與加工應用及生物粉體技術