缺血后處理對(duì)SH－SY5Y 細(xì)胞缺血再灌注模型的保護(hù)作用

李 燕 毛善平 翁小東 邢變枝 劉 軍

隨著介入技術(shù)的逐漸成熟，腦血管病介入治療漸趨普遍，然而介入治療后的再灌注損傷不容忽視，因此尋找有效的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)方法是臨床上亟待解決的問題。缺血后處理（Ischemic postconditioning，Postcond）指在缺血發(fā)生后長(zhǎng)時(shí)間再灌注之前對(duì)臟器進(jìn)行數(shù)次短暫的再灌注／缺血循環(huán)處理方法［1］。它與缺血預(yù)處理一樣，能夠減輕再灌注后臟器損傷，由于缺血后處理可在臟器缺血后應(yīng)用，故比缺血預(yù)處理具有更大的臨床應(yīng)用前景。

Postcond發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，目前研究者多采用動(dòng)物［2］或體外培養(yǎng)神經(jīng)元［3］來模擬Postcond的發(fā)生，研究顯示Postcond可以減小腦梗死的面積，提高動(dòng)物的神經(jīng)功能及行為評(píng)分，減少神經(jīng)元死亡。但在體模型受多種條件的限制，結(jié)果也容易受很多因素的干擾。體外培養(yǎng)原代神經(jīng)元可以使實(shí)驗(yàn)結(jié)果避免很多因素的干擾，提高可信度，但原代培養(yǎng)成功率低，神經(jīng)元自然老化等原因致無法保證持續(xù)傳代。SH－SY5Y 細(xì)胞系來源于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤（human neuroblastoma）株，具有類似神經(jīng)元的形態(tài)和生理生化特性，增值迅速，可以連續(xù)穩(wěn)定傳代，是進(jìn)行體外神經(jīng)系統(tǒng)研究的理想選擇。本研究應(yīng)用SH－SY5Y 細(xì)胞建立缺血再灌注損傷模型，并予以后處理，通過光鏡、熒光顯微鏡以及細(xì)胞計(jì)數(shù)（Cell Counting Kit－8）法、流式細(xì)胞術(shù)、SOD 活力檢測(cè)細(xì)胞從形態(tài)到功能的改變。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器

SH－SY5Y 細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫；DMEM／F12培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于Gibco公司；Cell Counting Kit－8（CCK－8）試劑盒購(gòu)于日本同仁化學(xué)研究所；Annexin V－FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海BestBio貝博生物；超氧化物歧化酶（SOD）WST－1法測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成有限公司；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA 裂解液（強(qiáng)）、Hoechst33342試劑購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。

三氣培養(yǎng)箱（長(zhǎng)沙華曦電子科技有限公司），酶標(biāo)儀（Perkin Elmer），倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯），流式細(xì)胞儀（Beckman Counter）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SH－SY5Y 細(xì)胞用DMEM／F12培養(yǎng)基、10%胎牛血清、100 U／ml青霉素及100 mg／ml鏈霉素于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2 d換液1次，3～4 d傳代1次，傳代時(shí)用0.25%胰酶室溫消化1 min。

1.2.2 缺血后處理模型構(gòu)建

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH－SY5Y 細(xì)胞以1.5×105／孔接種于直徑為35 mm 的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞完全貼壁后棄培養(yǎng)基，PBS 洗2 次，分為3 組分別為正常組、缺血再灌注組、缺血后處理組，如圖1a所示，缺血再灌注組和缺血后處理組于37 ℃、0.5%O2、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行糖氧剝奪12 h，參照Pignataro G等的做法［4］并加以改進(jìn)，如圖1b所示缺血后處理組予以3個(gè)循環(huán)正常培養(yǎng)10 min／糖氧剝奪10 min，再正常培養(yǎng)12 h，分別于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)、CCK－8試劑盒測(cè)定細(xì)胞的活力、hoechst染色于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的凋亡、Annexin－FITC和PI雙染于流式細(xì)胞儀定量分析細(xì)胞凋亡并測(cè)定細(xì)胞內(nèi)SOD 活力的改變。

圖1 缺血后處理模型建立流程圖

1.2.3 CCK－8法檢測(cè)細(xì)胞的活性

經(jīng)過處理的SH－SY5Y 細(xì)胞棄培養(yǎng)基后加入提前配制的CCK－8稀釋液（CCK－8 液：DMEM／F12完全培養(yǎng)為1∶9）0.5 ml，37 ℃避光培養(yǎng)4 h用酶標(biāo)儀在450 nm 測(cè)定各組細(xì)胞的吸光度（OD 值），細(xì)胞存活率%＝（實(shí)驗(yàn)組吸光度－空白對(duì)照組吸光度）／（陰性對(duì)照組吸光度－空白對(duì)照組吸光度）×100%。

1.2.4 Hoechst染色觀察細(xì)胞凋亡

向處理過的SH－SY5Y 細(xì)胞培養(yǎng)基中加入Hoechst染液，混勻后37 ℃孵育20 min，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的凋亡。

1.2.5 Annexin V－FITC和PI雙染凋亡檢測(cè)

經(jīng)過處理的SH－SY5Y 細(xì)胞收集培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，胰酶消化細(xì)胞，與之前收集的培養(yǎng)基及PBS一起離心12000 r／m×5 min，再用PBS 洗2次，加入400μl Annexin V 結(jié)合液懸浮細(xì)胞。向細(xì)胞懸浮液中加入5μl Annexin V－FITC 染色液，混勻于4 ℃避光孵育15 min；再加入10μl PI染色液混勻于4 ℃避光孵育5 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組SH－SY5Y 細(xì)胞的凋亡率。

1.2.6 細(xì)胞內(nèi)SOD 活力的測(cè)定

各組SH－SY5Y 細(xì)胞處理后棄培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑提取蛋白，按照超氧化物歧化酶（SOD）WST－1法測(cè)定試劑盒說明書測(cè)定各組SH－SY5Y 細(xì)胞SOD 的活力，用Bradford 法測(cè)定蛋白濃度。SOD 抑制率（%）＝［（A 對(duì)照－A 對(duì)照空白）－（A 測(cè)定－A 測(cè)定空白）］／（A 對(duì)照－A 對(duì)照空白）×100% ；SOD活力（U／mgprot）＝SOD 抑制率÷50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)÷待測(cè)樣本濃度（mgprot／ml）。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 SH－SY5Y 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

如圖2所示，倒置顯微鏡下觀察可見正常組細(xì)胞密集，細(xì)胞間連接緊密，軸突細(xì)長(zhǎng)均勻；缺血再灌注組活細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞皺縮變圓，細(xì)胞間連接稀疏；缺血后處理組的活細(xì)胞較缺血再灌注組明顯增加，細(xì)胞間連接較緊密，形態(tài)較規(guī)則。

圖2 光學(xué)顯微鏡下各組SH－SY5Y 細(xì)胞形態(tài)的改變

2.2 CCK－8法測(cè)定SH－SY5Y 細(xì)胞活性

經(jīng)缺血再灌注的細(xì)胞存活率較正常組明顯下降，為（69.669±2.467）%，與缺血再灌注組相比，缺血后處理組細(xì)胞存活率有所增加，為（78.66±7.038）%。任意兩組相比均有明顯差異（P＜0.01）（圖3）。

圖3 CCK－8試劑盒測(cè)定各組SH－SY5Y 細(xì)胞存活率

2.3 Hoechst染色觀察細(xì)胞凋亡

如圖4所示，經(jīng)Hoechst染色后在倒置熒光顯微鏡下觀察可見，正常組胞核染成淡藍(lán)色，缺血再灌注組較多的胞核致密濃染呈亮藍(lán)色，或呈碎塊狀致密濃染；缺血后處理組濃染的胞核較缺血再灌注組明顯減少。

2.4 Annexin V－FITC和PI雙染凋亡檢測(cè)

如圖4所示，與正常組相比，缺血再灌注組活細(xì)胞明顯減少，早期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞增加；經(jīng)缺血后處理的細(xì)胞，較缺血再灌注組的活細(xì)胞增加，早期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞減少。在流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為FITC－／PI－；右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為FITC＋／PI＋；而右下象限為早期凋亡細(xì)胞，F(xiàn)ITC＋／PI－（圖5）。

圖4 熒光顯微鏡下觀察各組SH－SY5Y 細(xì)胞Hoechst染色情況

圖5 Annexin V－FITC和PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

2.5 SH－SY5Y 細(xì)胞內(nèi)SOD 活力的測(cè)定

與正常組相比，缺血再灌注組SH－SY5Y 細(xì)胞內(nèi)SOD 活力由（22.318±1.340）U／mgprot下降至（11.991±2.128）U／mgprot，下 降46.27% （P＜0.01）；與缺血再灌注相比，缺血后處理組SH－SY5Y細(xì)胞內(nèi)SOD 活力由（11.991±2.128）U／mgprot上升至（15.892±4.690）U／mgprot，上升32.53%（P＜0.05）（表1）。

表1 各組SH－SY5Y 細(xì)胞SOD 活力的變化（±s，U／mgprot）

表1 各組SH－SY5Y 細(xì)胞SOD 活力的變化（±s，U／mgprot）

注：與正常組比較，△P＜0.005；與缺血再灌注組比較，＊P＜0.05

組別 SOD 活力正常組 22.318±1.340缺血再灌注組 11.991±2.128△缺血后處理組 15.892±4.690△＊

3 討 論

在缺血性腦卒中的治療中，無論是溶栓還是動(dòng)脈介入治療，目的都是使閉塞的腦動(dòng)脈再通，恢復(fù)梗死區(qū)的血液供應(yīng)。然而，再灌注過程往往加重組織細(xì)胞功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞，即再灌注損傷。缺血后處理（Ischemic postconditioning，Postcond）是新發(fā)現(xiàn)的一種機(jī)體內(nèi)源性抗再灌注損傷的保護(hù)現(xiàn)象，能夠減輕再灌注后臟器損傷，與預(yù)處理相比，后處理的臨床操作簡(jiǎn)便易行，在再灌注之前實(shí)施，時(shí)機(jī)易于掌握，可控性強(qiáng)，故可能具有更直接的臨床應(yīng)用價(jià)值。

Zhao等通過實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)：缺血后處理組心肌梗死范圍較對(duì)照組減小44%［1］。邢變枝等通過阻塞SD 大鼠大腦中動(dòng)脈60 min建立腦梗塞模型，之后給予5個(gè)循環(huán)的30 s缺血／30 s再灌注后處理，結(jié)果顯示Postcond可以減少腦梗塞面積，降低氧化應(yīng)激水平，改善神經(jīng)功能評(píng)分［4，5］。Jing－ye Wang等通過阻塞大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈造成全腦缺血，并給與類似的后處理，結(jié)果與局部腦缺血模型一致［6］。Pignataro等對(duì)體外培養(yǎng)神經(jīng)元實(shí)施120 min的糖氧剝奪（Oxygenglucose deprivation，OGD），制作體外缺血缺氧模型，再灌注10 min后實(shí)施10 min的OGD作為后處理措施明顯降低了細(xì)胞死亡［3］。缺血后處理對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)效果，其機(jī)制可能與減輕再灌注后細(xì)胞凋亡、減少氧自由基的生成、刺激內(nèi)源性NO 釋放、抑制炎癥有關(guān)，并參與PI3K／AKT、MAPK 等信號(hào)通路［7］，然而沒有現(xiàn)成的較合理的理論來解釋這一現(xiàn)象。

上述體內(nèi)研究受多種條件的限制，結(jié)果也容易受很多因素的干擾。體外培養(yǎng)原代神經(jīng)元可以使實(shí)驗(yàn)結(jié)果避免很多因素的干擾，提高可信度，但原代培養(yǎng)成功率低，神經(jīng)元自然老化等原因致無法保證持續(xù)傳代。本研究通過建立SH－SY5Y 細(xì)胞缺血再灌注損傷來研究Postcond的保護(hù)作用，不僅可以控制很多因素的干擾，而且SH－SY5Y 細(xì)胞易于培養(yǎng)，增值迅速，保證研究順利進(jìn)行。

本研究通過對(duì)SH－SY5Y 細(xì)胞進(jìn)行糖氧剝奪后正常培養(yǎng)來模擬缺血再灌注現(xiàn)象，倒置顯微鏡下缺血再灌注組的細(xì)胞較正常組細(xì)胞生長(zhǎng)密度明顯減少，細(xì)胞皺縮變圓，細(xì)胞間連接稀疏，經(jīng)CCK－8計(jì)數(shù)顯示存活率顯著下降（P＜0.01），Hoechst染色及流式細(xì)胞術(shù)均表明缺血再灌注組的細(xì)胞早期凋亡及壞死的比例較正常組增加，這與劉守躍［8］的研究結(jié)果一致。缺血后處理組SH－SY5Y 細(xì)胞的形態(tài)較缺血再灌注組規(guī)則，細(xì)胞生長(zhǎng)密度有所增加，細(xì)胞間連接較緊密，CCK－8 計(jì)數(shù)顯示細(xì)胞存活率由（69.669±2.467）%上升至（78.66±7.038）%。如圖4 所示，缺血后處理組SH－SY5Y 亮藍(lán)色的胞核較缺血再灌注組少。同樣，Annexin V－FITC 和PI雙染流式細(xì)胞術(shù)分析表明缺血后處理組SH－SY5Y 早期凋亡及壞死的比例較缺血再灌注組下降。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）作為清除氧自由基的酶，比較穩(wěn)定，可間接反應(yīng)氧自由基對(duì)細(xì)胞的損害程度。與缺血再灌注組相比，缺血后處理組SHSY5Y 細(xì)胞內(nèi)SOD 的活力有所增加（P＜0.05）。

根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為缺血后處理對(duì)SH－SY5Y 細(xì)胞缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用，細(xì)胞從形態(tài)到功能均得到不同程度的改善，這可能與抑制細(xì)胞凋亡及降低氧自由基的損傷有關(guān)。該體外模型的建立，為今后更好地研究缺血后處理的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。然而，Postcond究竟是一種“開或關(guān)”的現(xiàn)象，還是存在“量效關(guān)系”，仍需要進(jìn)一步深入研究，例如增加或減少缺血／再灌注時(shí)間、循環(huán)次數(shù)研究［9］。

1 Zhao Z－Q，Corvera JS，Halkos ME，et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion：comparison with ischemic preconditioning.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，285（2）：H579–88.

2 Skyschally A，Caster PV，liodromitis EK，et al.Ischemic postconditioning：experimental models and protocol algorithms.Basic Res Cardiol，2009，104（5）：469－483.

3 Pignataro G，Meller R，Inoue K，et al.In vivo and in vitro characterization of a novel neuroprotective strategy for stroke：ischemic postconditioning.J Cereb Blood Flow Metab，2008，28（2）：232－241.

4 Xing B，Chen H，Zhang M，et al.Ischemic postconditioning protects brain and reduces inflammation in a rat model of focal cerebral ischemia／reperfusion.Journal of Neurochemistry，2008，105（5）：1737－1745.

5 Xing B，Chen H，Zhang M，et al.Ischemic postconditioning inhibits apoptosis after focal cerebral ischemia／reperfusion injury in the rat.Stroke，2008，39（8），2362－2369.

6 Jing－ye Wang，Jia Shen，Qin Gao，et al.Ischemic Postconditioning Protects Against Global Cerebral Ischemia／Reperfusion－Induced Injury in Rats，Stroke，2008，39（3）：983－990.

7 Heng Zhao.Ischemic postconditioning as a novel avenue to protect against brain injury after stroke，J Cereb Blood Flow Metab，2009，29（5）：873－885.

8 劉守躍.OGD／R 模型誘導(dǎo)SH－SY5Y 細(xì)胞凋亡的蛋白組學(xué)研究，吉林大學(xué)博士學(xué)位論文，2008.

9 Zhi－Qing Zhao.Postconditioning in reperfusion injury：A status report.Cardiovasc Drugs Ther，2010，24（3）：265－279.