Combretastatins類腫瘤血管阻斷劑的構效關系研究*

周 全 ，陳建偉 ，劉曉蓉

1南京中醫藥大學藥學院，南京 210046；2南京圣和藥業有限公司，南京 210038

惡性腫瘤嚴重威脅著人類的健康，目前臨床上常用的抗腫瘤藥物既包括傳統的細胞毒藥物，也有新型的靶向抗腫瘤藥物。Combretum caffrum系一種非洲灌木，其根、皮一直被當地的Xhosa人用來治療癌癥[1]，從其樹干中提取分離得到的順式二苯乙烯類化合物考布他汀（Combretastatin A4）是目前已知微管蛋白抑制劑中活性最強的化合物之一[2]。1973年，美國國家癌癥研究所（NCI）首次對該種植物進行了采集[3]。1979年，亞利桑那州立大學Pettit GR教授的研究小組開始與NCI共同進行Combretum caffrum中化學成分的研究。至1987年，該小組先后從中分離得到了17個Combretastatins類化合物[4]（見圖1）。

圖1 Combretastatins類化合物的結構式

經篩選發現，在這些化合物中，Combretastatin A-4（CA4）及 CombretastatinA-1（CA1）的體外抗腫瘤活性及微管蛋白抑制效果最佳，且顯示出選擇性抑制腫瘤血管增生的活性[2]，屬于微管抑制型血管阻斷劑（vascular disrupting agent，VDA）。 由于 CA4和CA1的水溶性低，很難制成合適的劑型用于臨床，其磷酸鹽前藥CA4P和OXi4503及其他結構改造物應運而生。經過多年研究，目前活躍于臨床的Combretastatins化合物主要有CA4P（Ⅱ期）、Oxi-4503（Ⅱ期）及 AVE-8062（Ⅲ期）。

Combretastatins類抗腫瘤化合物結構中的順式雙鍵易異構化成反式構型，從而導致其半衰期較短。這個問題促使人們設計和合成改善順式構型限制的CA4衍生物，改造主要集中在兩個苯環的位置和順式雙鍵。本課題組依據晶體結構進行藥效基團構建，發現A環三個甲氧基中對位的甲氧基不是與靶點作用所必需的，依據此發現設計并合成了6個全新目標化合物，具體的名稱與結構見圖2、表1。

圖2 CA4衍生物的結構式

表1 6個CA4衍生物的取代基團

1 材 料

1.1 受試樣品、試劑

受試樣品由南京圣和藥業有限公司合成室合成所得。藥物及配制：CP001～CP020為測試藥物，陽性對照藥物為CA4及順鉑；藥物分別溶于DMSO（二甲基亞砜），并等比例稀釋成5個濃度（0.01～100 μmol·L-1）。

苯甲醛衍生物（上海海曲化工廠），常用試劑為市售分析純。

1.2 細胞株、培養基

K562（人粒性白血病）、MCF-7（人乳腺癌）、DU-145（人前列腺癌）、NCI-H460（人非小細胞肺癌）、HCT-116（人結腸癌細胞）均由本實驗室傳代并保種。

RPMl 1640培養基（含10%胎牛血清）。

1.3 儀器

YRT-3數字熔點儀；Bruker AV-300和 Bruker AV-500型核磁共振儀；Agilent LC-MSD-Trap-SL型質譜儀；ZF-Ⅰ型三用紫外分析儀；HSGF254型高效薄層層析板（煙臺江友硅膠開發有限公司）；柱層析硅膠（青島海洋化工廠，200～300目）。

Napco5420-I型及Sanyomc0175型CO2培養箱（Napco 公司和 Sanyo 公司）；Adventuxe:萬分之一電子天平 （Ohaus公司）；Wellscan MK3型酶標儀（Labsystems Dragon公司）；UV-260型紫外-可見分光光度儀 （Shimadza公司）；Spectra MAX fluorescence microplate reader熒光密度測定儀 （美國Gemini XS，Molecular Devices公司）。

2 方法與結果

2.1 結構鑒定

2.1.1 5-（3-羥基-4-甲氧基苯基）-4-（3，5-二甲氧基苯基）-1-（4-甲氧基苯基）咪唑（C001）白色固體，mp 131～134℃。1H-NMR（300 MHz，CDCl3） δ：3.92（s，6H，2×OCH3），4.07（s，3H，1×OCH3），4.13（s，3H，1×OCH3），6.40～6.43 （t，1H，1×Ar-H），6.71～6.81（m，7H，7×Ar-H），7.1（m，2H，2×Ar-H），7.67（s，1H，imidazole-H）。 ESI-MS m/z：433.2[M+1]+，分子量：432。

2.1.2 5-（3-羥基-4-甲氧基苯基）-4-（3，5-二甲氧基苯基）-1-（4-三氟甲基苯基）咪唑（C002）淡黃色固體，mp 111～113℃。1H-NMR（300 MHz，CDCl3）δ：3.72 （s，6H，2×OCH3），3.93 （s，3H，1×OCH3），6.34～6.35（t，1H，1×Ar-H），6.74～6.88（m，5H，5×Ar-H），7.11 （d，2H，2×Ar-H），7.64 （d，2H，2×Ar-H），7.88（s，1H，imidazole-H）。 ESI-MS m/z：471.2[M+H]+，分子量：470。

2.1.3 5-（4-二甲氨基苯基）-4-（3，5-二甲氧基苯基）-1-（4-三氟甲基苯基）咪唑（C003）淡黃色固體，mp 84～84.5℃。1H-NMR（300MHz，CDCl3）δ：3.67（s，6H，2×OCH3），6.62～6.64（m，2H，2×Ar-H），7.00～7.03（m，2H，2×Ar-H），7.24～7.25（m，2H，2×Ar-H），7.59～7.60（m，3H，3×Ar-H），7.67～7.68（m，2H，2×Ar-H），7.78 （s，1H，imidazole-H）。 ESI-MS m/z：468.2（M+1）+，分子量：467。

2.1.4 5-（3-氟-4-甲氧基苯基）-4-（3，5-二甲氧基苯基）-1-（3，4，5-三甲氧苯基）咪唑（300 MHz，

C004）白 色 固 體 ，mp 157～158.4℃ 。1H-NMR（CDCl3） δ：3.72 （s，12H，4×OCH3），3.85 （s，3H，1×OCH3），3.89（s，3H，1×OCH3），6.33（s，2H，2×Ar-H），6.36～6.37（d，1H，1×Ar-H），6.74～6.76（d，2H，2×Ar-H），6.89～6.92 （m，2H，2×Ar-H），6.95～6.97（m，1H，Ar-H），7.76 （s，1H，imidazole-H）。ESI-MS m/z：495.2（M+1）+，分子量：494。

2.1.5 5-（3，4，5-三甲氧基苯基）-4-（3,5-二甲氧基苯基）-1-（4-三氟甲基苯基）咪唑（C005）粘稠狀液體。1H-NMR（300MHz，CDCl3） δ：3.60（s，6H，2×OCH3），3.68（s，6H，2×OCH3），3.85（m，3H，1×OCH3），6.35～6.37（m，2H，2×Ar-H），6.78～6.79（d，2H，2×Ar-H），6.88（m，1H，1×Ar-H），7.28～7.30（m，2H，2×Ar-H），7.64～7.65（m，2H，2×Ar-H），7.82（s，1H，imidazole-H）。 ESI-MS m/z：515.2（M+1）+，分子量：514。

2.1.6 5-（4-二甲氨基苯基）-4-（3，5-二甲氧基苯基）-1-（3，4，5-三甲氧基苯基）咪唑（C006）淡黃色固體，mp 151～154℃。1H-NMR（300 MHz，CDCl3）δ（ppm）：2.93（s，6H，2×N-CH3），3.64～3.70（m，12H，4×OCH3），3.87（s，3H，1×OCH3），6.31～6.33（m，2H，2×Ar-H），6.37～6.39 （m，1H，1×Ar-H），6.62～6.64（m，2H，2×Ar-H），6.82～6.84（m，2H，2×Ar-H），7.04～7.06（m，2H，2×Ar-H），7.75 （s，1H，imidazole-H）。 ESIMS m/z：490.3（M+1）+，分子量：489。

2.2 體外抗腫瘤活性的測定

參照MTT法[5]，用酶標儀于570 nm波長下測量各孔的OD值[5]。根據孫氏綜合法（改進寇氏法）計算各測試藥物對各細胞株的半數抑制濃度（IC50），實驗結果見表2。

根據化合物的體外抑制腫瘤細胞增殖活性結果，初步的構效關系如下：化合物C001、C003、C004、C005、C006對所測的細胞菌株顯示了中等或較弱的抑制活性，而化合物C002對所測的5種細胞株均表現出較好的體外抗腫瘤活性，具有較廣的抗瘤譜。其體外抗腫瘤活性與對照藥CA4相當，具有進一步研究價值。

表2 化合物體外抗腫瘤活性

2.3 酶抑制的活性測定

從液氮罐中取出已純化的Tubulin（微管蛋白）置于1.5 mL離心管，放入冰盒。PMEG緩沖液配制適 量 的 含 有 5 μmol·L-1Tubulin 和 10 μmol·L-1DAPI染色液溶液，混勻，注意避光，放入冰盒中備用。將黑色96孔板放入冰盒中預冷，然后用微量移液器將含有 Tubulin（終濃度為 5 μmol·L-1）和 DAPI（終濃度為 10 μmol·L-1）的 PMEG 緩沖液加入 96 孔板后，將待測樣品加入至總體積為200 μL，對照組加入相同體積的DMSO。DMSO的終濃度保持在4%（V/V）以下。微孔內溶液快速混勻，并注意避免產生氣泡。將96孔板放入預熱到37℃的熒光酶標儀中，每一份樣品平行測定2組。激發光和發射光波分別設定在370 nm和445 nm，每隔1min測定一次，直到達到平臺期。藥物誘導微管蛋白裝配的EC50是聚合量達到最大聚合量50%時的藥物濃度。ΔF可用平臺期的熒光強度減去相應時間對照組的熒光強度得到。

應用GraphpaDPrism4軟件對ΔF與藥物濃度作圖，并根據下述公式得到半數有效濃度EC50值，計算公式:ΔF=ΔFmaxX[drug]/（EC50+[drug]）。

按這一公式計算，化合物抑制微管蛋白聚合活性結果見表3。

表3 化合物抑制微管蛋白聚合活性

通過以上藥效實驗，發現化合物C002體外抗腫瘤活性與CA4相當。構效關系分析表明：B環的取代對于活性影響較大，3-OH、4-OCH3和3-F、4-OCH3的化合物活性較好，改變為其他的取代基則活性喪失。

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