拌種靈丙氨酸衍生物的合成及其對大豆細胞穿透行為研究

趙 陽，胡 奎，李俊凱，方祖凱，杜鐵鋼(長江大學農學院，湖北 荊州434025)

拌種靈丙氨酸衍生物的合成及其對大豆細胞穿透行為研究

趙 陽，胡 奎，李俊凱，方祖凱，杜鐵鋼(長江大學農學院，湖北 荊州434025)

通過將拌種靈與丙氨酸拼接，合成了拌種靈丙氨酸衍生物，利用核磁共振氫譜和質譜進行了表征。以拌種靈為對照藥劑，檢測了該衍生物對水稻紋枯病的室內活性，以及懸浮培養條件下大豆細胞對拌種靈丙氨酸衍生物的吸收行為。結果表明，拌種靈及其丙氨酸衍生物對水稻紋枯病菌的EC50分別為(2.91±1.39)mg/L和(8.05±1.25)mg/L；在20mg/L的該藥劑培養液中培養2h后，利用HPLC法檢測大豆細胞內拌種靈丙氨酸衍生物含量為30.56mg/kg(FW)，而相同條件下拌種靈在大豆細胞中含量僅為4.96mg/kg(FW)?？梢?，拌種靈氨基酸衍生物殺菌活性下降，但對大豆細胞的穿透能力顯著增強。說明丙氨酸官能團能引導該衍生物通過主動吸收的方式進入植物細胞。

拌種靈丙氨酸衍生物；合成；大豆細胞；穿透

內吸性殺菌劑由于能滲透到植物體內并可傳導至施藥部位，自20世紀60年代應用于防治植物病害以來，使得植物病害化學防治的面貌大為改觀，已經成為植物病害化學防治的主力軍[1]。但由于大多數內吸性殺菌劑只有向頂性傳導，不能有效地從上向下傳導或者傳導作用微弱，使得根部不能達到有效的防治濃度，因此采用葉面噴霧控制植物根部或微管束病害以及土傳病害達不到防病的效果。長期以來，人們一直尋求能通過噴霧防治植物根部病害的藥劑，特別是能雙向傳導的藥劑[2]。

導向農藥是農藥的有效成分在導向基團引導下能向植物特定部位傳導積累的農藥[3]。作為導向基團，必須具備能引導整個分子進入植物體并向特定部位傳導的功能。氨基酸在植物的生命活動中，具有重要的地位，并且在植株體內的運轉主要在韌皮部內進行[4]，這個過程需要質膜上特定的載體來完成，設想如果將氨基酸和高效殺菌劑進行結合，在不屏蔽各自功能結合位點的前提下，有望得到能被氨基酸載體轉運的新的化合物分子[5]。Chollet等[6]采用藕合的方法從天門冬氨酸、谷氨酸和賴氨酸出發，合成了一系列α-氨基酸的衍生物，并試驗了賴氨酸-2,4-D對蠶豆離體葉片從溶液中吸收葡萄糖、蔗糖和蘇氨酸的影響，發現這種影響非常顯著[7]，同時該化合物在葉片中的吸收也明顯增加[8]；利用蠶豆植株進行的生物活性試驗，發現該化合物具有與2,4-D同樣的生物活性；通過在8葉期的蓖麻植株上的傳導試驗證明，當施用在植株的第4、5片葉上后，在植株上下各部位都能檢測到這種化合物的存在，并且在臨近的葉片和旺盛的生長點的含量高于對照所使用的賴氨酸和2,4-D的含量，由此提出了假設，可能賴氨酸-2,4-D能在載體的介導下在植株的韌皮部移動[9]。

本研究從導向農藥的角度，將丙氨酸與拌種靈通過拼接合成，并試驗了懸浮培養條件下大豆細胞對新化合物的吸收，為進一步篩選能在韌皮部傳導的殺菌劑奠定基礎，并為構建能在韌皮部傳導的新型殺菌劑的開發提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

(1)供試植物及處理 將大豆(Glycinemax(L.) Merrill)種子進行無毒處理后在固體培養基上無菌萌發。從1周齡的無菌實生苗取莖尖頂端大約3～5mm的部分直接用作外植體。按照成雄鷹[10]的方法，誘導用基本培養基為MS培養基，愈傷組織形成后，轉移至液體培養基中在恒溫搖床上進行懸浮培養，培養條件為溫度25℃，搖床轉速為121r/min。培養15d進行繼代轉接培養，繼續培養8d后供試驗用。

(2)供試植物病原菌 供試菌種水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)由華中農業大學植物科技學院植物病理系提供。

(3)主要試劑 丙氨酸：上海生化試劑公司生產；97%(w/w)的拌種靈原粉：江蘇南通江山農藥化工股份公司提供；95%(w/w)的氯代甲酸芐酯：江蘇省新沂市匯力精細化工有限公司生產；40%(w/w)HBr的冰醋酸溶液：湖北省南漳縣襄九精細化工有限責任公司；醋酸鋅、多聚甲醛、對甲苯磺酸、氯化亞砜等試劑均為市售分析純。

(4)主要儀器 6ml的C18反相鍵合固定相SPE柱;LABOROTA 4001型旋轉蒸發儀(德國博勵行公司);Bruker 400型核磁共振儀(瑞士布魯克公司);Agilent 1100 HPLC-MS儀(美國安捷倫公司);WRR熔點測定儀(上海精密科學儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

(1)拌種靈丙氨酸衍生物的合成 拌種靈丙氨酸衍生物合成路線如圖1所示。在500ml圓底燒瓶中，將15g L-丙氨酸溶于200ml 2mol/L的NaHCO3溶液中，0～10℃下加入35g氯代甲酸芐酯，攪拌反應1h，轉入分液漏斗中，用乙醚洗滌2次，水相用6mol/L的HCl調pH至2左右，用乙酸乙酯萃取50ml×3，乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，析出白色結晶，得化合物Ⅰ。將0.01mol的化合物Ⅰ和0.05mol(3.7ml)的氯化亞砜及2ml四氯化碳加入到50ml長頸燒瓶中，加上冷凝和干燥設備，回流至無氣體放出，蒸去溶劑至無HCl和SO2放出，再加入干燥的二氯甲烷10ml，然后蒸去溶劑，得化合物Ⅱ。

圖1 拌種靈丙氨酸衍生物合成路線

在100ml的長頸燒瓶中，將拌種靈原藥樣品0.01mol(2.33g)溶于25ml的經金屬鈉干燥過的四氫呋喃中，通干燥的氮氣，加入1.1ml干燥的三乙胺，冰浴中分次少量滴加0.01mol的化合物Ⅱ。60℃回流3h，冷卻至室溫，反應15h，薄層色譜跟蹤反應進程。待反應結束后，減壓蒸去四氫呋喃，體系溶于50ml的二氯甲烷中，混合物用15ml水洗，15ml 0.5mol/L的HCl溶液洗滌，15ml NaHCO3飽和溶液洗滌，再用水洗至中性。有機相用MgSO4干燥，蒸去溶劑，柱層析凈化，流動相為石油醚和乙酸乙酯梯度洗脫。產物為白色固體Ⅲ。在50ml的圓底燒瓶中加入待脫保護的化合物0.01mol，加入HBr的冰醋酸溶液10ml，常溫反應2h，減壓濃縮蒸發掉HBr和冰醋酸，加入10ml水溶解，加入0.5mol/L的NaOH溶液至不再產生沉淀，過濾，用10ml的冰水洗固體，然后用甲醇重結晶，得產物Ⅳ，產率為47%，白色固體，熔點高于260℃。

(2)室內抑菌活性試驗 采用菌絲生長速率抑制法[11]測定拌種靈氨基酸衍生物室內抑菌活性，并用拌種靈原粉作為對照，按照下式計算藥液對菌絲生長的抑制率，計算藥劑對水稻紋枯病菌的EC50。

(3)懸浮培養條件下大豆細胞對拌種靈氨基酸衍生物的吸收檢測 配制一定量的植物細胞懸浮培養的營養液，滅菌處理。準確稱取一定量的拌種靈氨基酸衍生物，用少量溶劑溶解后，用營養液定容到一定體積，使營養液中供試藥劑的濃度為20mg/L。將處于生長旺盛期的植物細胞過濾，迅速轉入含藥營養液中，繼續懸浮培養一定時間，按照文獻[12]的方法利用HPLC分別測定0.5、1、2、3、5h后細胞中供試藥劑的含量。

2 結果與分析

2.1 拌種靈氨基酸衍生物的表征

目標化合物拌種靈氨基酸衍生物(化合物IV)的結構經NMR和MS分析，核磁共振譜測定結果如下：1HNMR (400MHz,CH3COCH3)δ：1.38(d,J=6.8,3H,CH3-C-N),2.62(s,3H,CH3-thiazol),3.79(t,J=6.8,1H,OC-CH-N),7.08～7.78(m,5H,C6H5)。13CNMR (400MHz,CH3COCH3) δ： 16.1,17.5,54.1,120.0,121.0(2C),124.6,129.4(2C),140.0,152.4,156.4,161.5,176.2；質譜測定結果為(ESI-MSm/z)： 609.4[2M+H]+,305.2[M+H]+,234.2[M-C3H6NO]+。

2.2 拌種靈氨基酸衍生物室內抑菌活性

以水稻紋枯病菌為供試菌種，拌種靈丙氨酸衍生物對水稻紋枯病菌的毒力曲線方程為y=3.8533+1.2657x，相關系數為0.9591，EC50為(8.05±1.25)mg/L。而對照藥劑拌種靈對水稻紋枯病的毒力曲線方程為y=4.2592+1.5990x，相關系數0.9876，EC50為(2.91±1.39)mg/L?？梢姡瑥纳锘钚缘臏y定結果看，拌種靈丙氨酸衍生物的生物活性與拌種靈相比有所下降。

2.3 處理不同時間后大豆細胞中供試藥劑的含量

圖2 處理不同時間后細胞內供試藥劑的含量

大豆細胞分別在20mg/L拌種靈和拌種靈丙氨酸衍生物的液體培養液中懸浮培養不同時間，HPLC測定細胞內化合物含量的結果見圖2。

從圖2可知，拌種靈進入細胞體內的量隨著時間的推移逐漸增加，到5h時，也未超過細胞外的濃度。而拌種靈丙氨酸衍生物進入大豆細胞的速率遠遠高于拌種靈，懸浮培養1h后就高于細胞外濃度，2h達到最高值，在隨后的時間逐漸降低。這一結果初步說明拌種靈進入細胞內的過程是一個被動擴散的過程，拌種靈氨基酸衍生物由于存在氨基酸官能團，細胞的吸收可能由于位于細胞膜上氨基酸的載體參與了運載，是個主動吸收的過程。對于植物細胞而言，載體的參與可以使細胞內的量高于環境中的濃度，因此在短時間內細胞中化合物含量迅速升高；而這些進入細胞內的氨基酸的衍生物畢竟不是植物合成蛋白質所需要的氨基酸，因此同樣可以在載體的協助下被排除細胞體外。因此當細胞內拌種靈丙氨酸衍生物的含量達到最高值后會逐漸降低到某一相對平衡的水平。

3 討論

拌種靈作為一種頂向傳導的內吸性殺菌劑，經過與丙氨酸化合后形成了拌種靈丙氨酸的衍生物，雖然殺菌活性有一定程度的降低，但其進入植物細胞的能力得到了提升，拌種靈丙氨酸衍生物能夠借助于大豆細胞膜上的轉運載體，通過主動吸收的方式進入細胞內。

在農藥的施用過程中，人們都努力使藥劑覆蓋有害生物的整個棲境及被保護作物本身，由于霧滴飄移和其它環境因素的影響，到達生物靶體的農藥量極低。以植物體為間接靶體，農藥的有效沉積率為20%～40%，損失浪費的農藥約60%～80%；以農業害蟲為靶體，有效利用率為1/104～1/1011，平均為1/107。而以病原物為靶標，能到達病原物寄居部位的農藥有效成分就更低[13]。拌種靈作為一種內吸性殺菌劑，殺菌譜廣。但由于單向輸導性，使用受到限制。與丙氨酸結合后，雖然殺菌活性有所下降，但能在丙氨酸官能團的引導下，通過主動運輸的方式接入大豆細胞。這一過程可能借助于細胞膜上的氨基酸的載體完成的，因為細胞膜上氨基酸的載體既有一定的專一性，又有一定的廣譜性。目前這些載體蛋白的大多數調控基因已經被定位，并用這些載體蛋白基因缺失體的植株來進行許多克隆基因的生理功能的研究。如命名為YPL265W的DIP5基因能調控谷氨酸和天門冬氨酸這2種酸性氨基酸的載體蛋白，而命名為YKR039W的GAP1基因幾乎可以調控常規的氨基酸的載體蛋白。

一些具有殺菌譜廣、活性高的內吸殺菌劑通過衍生，改善其傳導性后有可能煥發新的活力，是新型殺菌劑開發的新思路。結合本研究結果，對化合物在植物體內的傳導性可作進一步深入研究。

[1] 李俊凱，徐漢虹，王 勇.殺菌劑在韌皮部的傳導性研究進展[J].世界農藥，2009，31(1)：26-31.

[2] Edgington L V.Structural requirements of systemic fungicides[J].Annu Rev Physiol.,1981,19:107-114.

[3]徐漢虹，張志祥，程東美,等.導向農藥[J].世界農藥，2004，26(5)：3-10.

[4]Bush D R.Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants[J].Annu Rew Plant Physiol Plant Mol Bio,1993,44:513-542.

[5] Milton H S.Families of transmembrane transporters selective for amino acids and their derivatives[J].Microbiology,2000,146:1775-1795.

[6] Chollet J F,Miginiac L,Rudelle J,et al.A convenient method of protection and mild deprotection of α-amino acid group for the synthesis of functional α-amino acids[J].Synthetic communications,1993,23:2101-2111.

[7]Dufaud A,Chollet J F,Rudelle J,et al.Derivatives of pesticides with an α-amino acid function:Synthesis and Effect on threonin uptake[J].Pestic Sci,1994,41:297-304.

[8]Chollet J F,Deletage C,Faucher M,et al.Synthesis and structure-activity relationship of some pesticides with an α-amino acid function[J].Biochimeca Et Biophysica Acta,1997,1336:331-334.

[9] Grandon D,Chollet J F,Faucher M,et al.Carrier-mediated uptake and phloem systemy of a 350-Dalton Chlorinated xenobiotic with an α-amino acid function[J].Plant Physiol,2001,125:1620-1632.

[10] 成雄鷹.Somatic Embryogenesis from Protoplast-derived Callus in Soybean (GlycinemaxL.)[J].浙江大學學報(農業與生命科學版)，1991，17(1)：106-114.

[11] NY/T 1156.2-2006.農藥室內生物測定試驗準則[S].北京：中國農業出版社,2006.

[12] 胡 奎，趙 陽，張 旭，等.故鄉萃取HPLC法測定煙草植株中拌種靈殘留量研究[J].安徽農業科學，2012,40(13)：7737-7738.

[13] 陳萬義，薛振祥，王能武.新農藥的研究與開發[M].北京：化學工業出版社，1995:143-145.

S482.2

A

1673-1409(2012)05-S012-04

2012-04-10

國家自然科學基金項目(30971948)；湖北省教育廳資助項目(Q200712002)；國家大學生創新性實驗計劃項目(101048913)。

趙 陽(1988-)，男，寧夏隆德人，現從事新農藥開發研究。

李俊凱，E-mailjunkaili@sina.com。

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.05.004