食品中己烯雌酚的檢測方法

王 瑤，周建華，張鴻雁，邴 欣

（1.山東師范大學生命科學學院，山東濟南250014；2.山東省產品質量監督檢驗研究院，山東濟南250103）

食品中己烯雌酚的檢測方法

王 瑤1，周建華1，張鴻雁1，邴 欣2，*

（1.山東師范大學生命科學學院，山東濟南250014；2.山東省產品質量監督檢驗研究院，山東濟南250103）

己烯雌酚是人工合成的雌激素，主要添加在飼料中，能引起人體內激素失調等疾病。綜述了己烯雌酚的理化性質、存在的危害、測定方法等，重點介紹了己烯雌酚的定性和定量測定方法，為我國食品檢測方法的研究提供借鑒的依據。

己烯雌酚，雌激素，食品，測定方法

己烯雌酚（Diethylstilbestrol）是一種人工合成的雌性激素類藥物，常當做性激素調節動物的生理功能，還被用作動物飼料添加劑，以促進動物的生長。國內外研究表明，己烯雌酚可以破壞機體的遺傳物質，導致基因突變，引發腫瘤。由于己烯雌酚的濫用，對動物性食品中己烯雌酚的殘留檢測引起了國內外的高度重視。目前己烯雌酚的檢測方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、酶聯免疫分析法、電化學法和熒光測定法等。

1 己烯雌酚的理化性質

己烯雌酚別名丙酸己烯雌酚、女性素、人造求偶素等，分子式C18H20O2，相對分子質量268.35，化學名稱（E）-4，4’-（1，2-二乙基-1，2-亞乙烯基）雙苯酚。己烯雌酚是一種無色結晶或白色結晶性粉末，幾乎無臭、無味。有兩種幾何異構體，其中反式作用較強，用于醫藥。熔點169～172℃，紫外最大吸收波長為242nm。幾乎不溶于水，溶于乙醇、氯仿、乙醚、脂肪油、稀氫氧化鈉溶液。Coats[1]通過模型生態系統的研究發現，己烯雌酚在環境中降解很慢，能夠在生物體中積累，造成對環境的污染和對生物體的危害。己烯雌酚的化學結構式見圖1。

圖1 己烯雌酚的化學結構式Fig.1 Chemical structure of diethylstilbestrol

2 己烯雌酚的存在及危害

己烯雌酚是人工合成的非甾體雌激素，屬于雌激素及孕激素類藥物。它在促進動物蛋白質的合成代謝、提高動物日增重和減少脂肪等方面效果明顯[2]，另外具有增加瘦肉率、治療胎衣不下、排出死胎以及提高飼料轉化率等功能而廣泛應用于畜牧業[3]。將其添加到飼料里可以提高產崽率或催情作用，同時通過飼喂會使己烯雌酚殘留在動物的內臟以及肌肉組織中[4]。它存在于動物源性食品中，如果在肝臟、雞肉、蛋、奶中殘留，被人食用后能夠損傷肝臟，引起少兒的發育早熟、男性女性化、破壞機體遺傳物質、導致基因突變[5]以及人體內激素失調，女性乳腺癌、卵巢癌等疾病[6]。

目前世界上許多國家已經規定己烯雌酚在家畜禽和水產養殖業中禁用。我國于1999、2002年先后兩次制定法規禁止DES及其鹽、酯制劑用于所有食品動物的所有用途[7-9]。然而，由于巨大經濟利益的驅使，濫用己烯雌酚的現象依然存在。因此加強對飼料產品中己烯雌酚的監測可以保障食品安全工作的順利開展，從而保護人的健康與安全。

3 己烯雌酚的測定方法

3.1 高效液相色譜法

近幾年，高效液相色譜法大量用于食品和飼料中己烯雌酚的測定，該法已經成功地應用于肉制品、奶粉、海產品和飼料中己烯雌酚含量的測定，使用較廣泛的是甲醇和磷酸二氫鈉溶液為流動相，采用熒光或紫外檢測器檢測，該法有較好的精密度和準確度。

萬美梅等[10]建立了動物組織中己烯雌酚的高效液相色譜檢測方法，流動相為乙腈和磷酸二氫銨，己烯雌酚濃度在0.2～100ng/g范圍內具有良好線性關系，相關系數為0.9995。各組織不同添加濃度的平均回收率均為80%，批內變異系數小于3.60%，批間變異系數小于3.72%，檢測限為0.2ng/g。張彩虹[11]用甲醇二次提取畜禽肉及內臟中己烯雌酚，按常規取樣5g時最小檢出濃度0.24mg/kg，加標回收率分別為98.7%～104.3%和99.6%～101.7%，精密度小于5%，相關系數為0.9996。劉虹等[12]建立測定奶粉中己烯雌酚的高效液相色譜法，測定己烯雌酚的線性范圍0.5～200g/mL，相關系數為0.9995，平均回收率92.2%，檢出限為0.06μg。林紅英等[13]建立了鰻魚肉中己烯雌酚的高效液相色譜檢測方法，平均回收率可達84%以上，相對偏差小于15%，最低檢測限為10μg/kg。

Xu等[14]通過高靈敏的高效液相色譜熒光檢測器檢測水產品中己烯雌酚的含量。通過在濃硫酸中的磺化反應和水解作用，把己烯雌酚轉變成能夠發射出熒光的物質，并用高效液相色譜的方法進行測定，檢測下限是0.1μg/kg，回收率超過86%，相對標準偏差小于6.2%。

液相色譜-質譜聯用常被用于己烯雌酚含量的確證，分析過程包括提取、樣品預處理和帶有四級離子捕獲質譜分析器的電噴霧質譜定性的反相高效液相分離過程。色譜條件：流動相為乙腈-水，流速0.2mL/min，進樣體積10μL，柱溫35℃。在0.1～500μg/L濃度范圍內呈良好的線性，相關系數為0.999。在1、5、20mg/kg 3個添加水平，平均回收率75.2%～97.6%，日內變異系數為2.1%～6.3%，日間變異系數為3.2%～9.7%，檢測限為10μg/kg[16]。常碧影等[17]建立了液相色譜-質譜法測定飼料中己烯雌酚的分析方法，最低檢出限0.5ng，回收率平均92.86%，平均變異系數5.64%，適合多種動物各種飼料品種中己烯雌酚的測定。

3.2 氣相色譜

只要己烯雌酚在分離柱溫度范圍內可揮發或可轉化為可揮發物質，氣相色譜就可用于測定己烯雌酚。宮向紅等[15]建立了水產品中己烯雌酚的氣相色譜-質譜檢測方法，當添加水平在0.5～1.0μg/kg時，回收率大于75%，相對標準偏差為0.9%～2.7%，相關系數為0.999。

3.3 酶聯免疫分析法

以上介紹的檢測己烯雌酚的各種方法往往需要復雜昂貴的儀器，而且需要經過繁瑣的前處理，很難達到快速、簡便的現場檢測要求。酶聯免疫分析方法具有特異性強、靈敏度高、簡便和快速等優點。這些豐富的分析研究成果對于監測和安全使用己烯雌酚起到了十分重要的作用。

Wang等[18]用試劑盒進行酶聯免疫吸附實驗測定己烯雌酚的殘留。Wang等[19]運用多克隆抗體進行間接競爭酶聯免疫方法測定己烯雌酚，己烯雌酚的檢測下限是0.01ng/mL，IC50值為1.02ng/mL，回收率為86%～120.2%。Wang等[20]又用單克隆抗體通過間接競爭酶聯免疫實驗測定己烯雌酚，IC50值為9.8ng/mL，檢測下限是2.3ng/mL，檢測的線性范圍是2～42ng/mL。Xu等[21]運用競爭的酶聯免疫吸附實驗對己烯雌酚進行了定量測定，對雞肉和肝臟組織進行了檢測，IC50值為2.4ng/mL，檢測下限是0.07ng/mL。Goldstein P等[22]為了定量檢測組織、細胞和亞細胞中的己烯雌酚的濃度，將KLH和半抗原偶聯制備抗己烯雌酚抗體，應用改良的酶聯免疫方法對己烯雌酚進行研究。

胡鯤等[23]用國外進口試劑盒測定中華鱉肌肉中己烯雌酚殘留量，檢測下限是0.0125μg/kg，平均回收率為74.8%，變異系數為1.763%～3.084%。王文[24]等建立了間接競爭酶聯免疫吸附分析方法，該方法的最低檢測限為0.04ng/mL。廖敏等[6]通過對羅非魚和對蝦樣品加標回收實驗，試劑盒在加標濃度為1.00μg/kg和2.00μg/kg時，對蝦和羅非魚樣品的加標回收率為78.80%～93.30%。邴愛英[25]等用酶聯免疫法進行實驗，該方法的檢測靈敏度為0.125ng/mL，可定量檢測范圍是0.25～15.60ng/mL。Degand[26]用酶聯免疫法測定牛尿液中己烯雌酚含量，最低檢測限是0.09ng/mL，完全滿足歐盟對己烯雌酚允許的最大殘留量為2μg/kg的要求。

3.4 電化學法

己烯雌酚分子中的酚羥基具有電化學活性，在多壁碳納米管修飾玻碳電極上出現靈敏的氧化峰。而在同樣的條件下，己烯雌酚在裸玻碳電極上的電化學活性卻低得多，因此可用電化學方法測定己烯雌酚。

王術皓等[27]建立了一種測定己烯雌酚的電化學酶免疫分析新方法，此方法測定的己烯雌酚線性范圍是1.0～500ng/mL，檢出限為0.4ng/mL。孫延一等[28]制作了碳納米管修飾電極，并研究己烯雌酚在該電極上的電化學行為。峰電流與己烯雌酚濃度在1×10-8～2×10-6mol/L有良好的線性關系，檢測限為2.5×10-9mol/L。1×10-6mol/L己烯雌酚溶液的相對標準偏差為2.9%。吳翠敏[29]在玻碳電極上，在pH=9.0的磷酸鹽緩沖溶液中，己烯雌酚對Luminol（發光試劑）的電化學發光有一定的抑制作用，己烯雌酚濃度在1.5×10-6～2.5× 10-5mol/L范圍內與發光減少值分段呈良好的線性關系，檢出限為5.0×10-7mol/L。對5.0×10-5mol/L己烯雌酚平行測定10次，其相對標準偏差為3.28%。

3.5 熒光測定法

基于己烯雌酚與濃硫酸反應后的水解產物的熒光性質，可建立一種測量己烯雌酚的熒光光度分析方法。潘祖婷等[30]研究了不同環境介質對產物熒光性質的影響，在0～4.5×10-6mol/L濃度范圍內，熒光強度與濃度之間呈良好的線性關系，相關系數為0.9996，檢測限為2.0×10-8mol/L。

4 結論

由于己烯雌酚的濫用，國內外開始高度重視食品中己烯雌酚的檢測。己烯雌酚在動物體內代謝快，在組織中濃度低，因此其檢測方法應準確、靈敏、特異和精確[10]。己烯雌酚的定性以及定量測定方法的研究涉及樣品處理方法、檢測器靈敏度、雜質干擾等諸多因素的影響。根據實際需要，可選用適宜的測定方法。目前我國應盡快制定己烯雌酚的含量測定的國標方法，為我國食品安全等行業的發展提供借鑒的依據。

[1]Coats JR，Metcalf RL，Lu PY，et al.Model ecosystem valuation oftheenvironm ental impacts of the veterin ary drug phenothiazine，sulfamethazine，clopidol and diethylstilbestrol[J].Environ Health Perspect，1976（18）：167-179.

[2]Lone KP.Natural sex steroids and their xenobiotic analogs in animal production：growth，carcass quality，pharmaco kinetics，metabolism，mode of action，residues，methods and epidemiology [J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition，1997，37（2）：193-209.

[3]倫麗麗，董英，王云，等.己烯雌酚完全抗原及其單抗的制備與分析[J].黑龍江畜牧獸醫，2009（10）：67-69.

[4]賈濤.酶聯免疫法檢測飼料中己烯雌酚的探討[J].飼料廣角，2010（5）：38-40，43.

[5]李凱年，姜荃.國外對食品藥物殘留控制的發展趨勢[J].世界農業，2003（5）：44-46.

[6]廖敏，錢莉.酶聯免疫法：水產品中己烯雌酚檢測新招[J].農業技術與裝備，2009（10）：28-29.

[7]動物性食品中獸藥最高殘留限量[S].中華人民共和國農業部，1999.

[8]動物性食品中獸藥最高殘留限量[S].中華人民共和國農業部，2002.

[9]Becker J.Artificial hormones European register[J].Nature，1981，289：215.

[10]萬美梅，陳杖榴，劉雅紅，等.動物組織中己烯雌酚殘留的高效液相色譜/電化學檢測方法研究[J].中國獸藥雜志，2004，38（7）：4-6.

[11]張彩虹.高效液相色譜法測定己烯雌酚的實驗研究[J].中國熱帶醫學，2006，6（2）：328-329.

[12]劉虹，謝承恩.高效液相色譜法測定奶粉中己烯雌酚[J].檢測技術，2006，12（6）：374-375.

[13]林紅英，蔣天梅，沈子龍.鰻魚肉中己烯雌酚殘留量的高效液相色譜法測定[J].江蘇農業學報，2006，22（4）：456-459.

[14]Xu YJ，Geng JP，Zhang XZ，et al.Determination of diethylstilbestrol in aquatic products by high performance liquid chromatography with fluorescence detection[J].Chinese Journal of Chemistry，2010，28（1）：86-90.

[15]宮向紅，徐英江，張秀珍，等.氣相色譜-質譜法測定水產品中的己烯雌酚[J].食品科學，2009，30（2）：168-169.

[16]閆小峰，孫志文.超高效液相色譜-串聯質譜法測定飼料中的己烯雌酚[J].檢測分析，2010（11）：38-40.

[17]常碧影，張萍，袁漢成，等.LC-MC測定飼料中己烯雌酚方法的研究[J].現代科學儀器，2003（1）：38-41.

[18]Wang W，Li J，Xu T.Detection kit for enzyme linked immunosorbentassay applied for diethylstilbestrolresidue analysis[P].China.CN1967247-A，2007-05-23.

[19]Wang WJ，Ling Y，Xu T，et al.Development of an indirect competitive ELISA based on polyclonal antibody for the detection of diethylstilbestrol in water samples[J].Chinese Journal of Chemistry，2007，25（8）：1145-1150.

[20]Wang WJ，Li J，Zhao JX，et al.Development of monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay to the estrogen diethylstilbestrol[J].Chinese Journal of Chemistry，2006，24（12）：1758-1765.

[21]Xu CL，Chu XG，Peng CF，et al.Comparison of enzymelinked immunosorbent assay with liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the determination of diethylstilbesterol residues in chicken and liver tissues[J].Biomedical Chromatography，2006，20（10）：1056.

[22]Goldstein P.Biologicalresponse and quantitation of diethylstilbestrol via enzyme-linked-immunosorbent-assay[J]. Acs Symposium Series，1991，451：280-292.

[23]胡鯤，楊先樂，張菊.酶聯免疫法檢測中華鱉肌肉中己烯雌酚[J].上海水產大學學報，2002，11（3）：199-202.

[24]王文，李季，張國中，等.己烯雌酚多克隆抗體的制備研究[J].農業環境科學學報，2005，24（增刊）：245-250.

[25]邴愛英，成連貴，褚新星，等.己烯雌酚酶聯免疫檢測方法的建立[J].西南農業學報，2006，19（6）：1159-1161.

[26]Degand G，Schmitz P，Maghuin-Rogister G.Enzyme immunoassay screening procedure for the synthetic anabolic estrogens and androgens diethylstilbestrol nortestosterone，methyltestosterone and trenbolonein bovine urine[J].J Chromatogr，1989（489）：235-243.

[27]王術皓，莊惠生，王傳濤，等.電化學免疫分析方法測定飼料中的己烯雌酚[J].持久性有機污染物論壇，2006：347-350.

[28]孫延一，吳康兵，胡勝水.己烯雌酚在多壁碳納米管修飾電極上的電化學行為及其電化學測定[J].藥學學報，2003，38（5）：364-367.

[29]吳翠敏.己烯雌酚在玻碳電極上的電化學發光法研究[J].海峽藥學，2005，17（2）：46-48.

[30]潘祖亭，姚禮峰，馬紅燕.己烯雌酚熒光性質的研究及其分析應用[J].武漢大學學報，1997，43（6）：701-705.

Review on detection methods of diethylstilbestrol in food

WANG Yao1，ZHOU Jian-hua1，ZHANG Hong-yan1，BING Xin2，*
（1.College of Life Science，Shandong Normal University，Jinan 250014，China；2.Shandong Supervision and Inspection Institute for Product Quality，Jinan 250103，China）

Diethylstilbestrol is an artificial synthetic estrogen，mainly added in fodder，and can cause an imbalance of human body hormone.The physicochemical property，presence，the harm to human health and detection methods of diethylstilbestrol were reviewed.Qualitative and quantitative detection methods of diethylstilbestrol were introduced in detail，which could offer a helpful reference for further study of detection methods of diethylstilbestrol in food.

diethylstilbestrol；estrogen；food；detection methods

TS207.3

A

1002-0306（2012）03-0373-03

2011－02－28 *通訊聯系人

王瑤（1986-），女，碩士，研究方向：食品安全檢測。

山東省質量技術監督局科研項目（2009KYZ05）；第四十七批博士后基金（20100471569）。