谷氨酰胺轉氨酶對堿溶酸沉法提取南極磷蝦(EUPHAUSIA SUPERBA)蛋白質得率的影響

王靈昭，薛長湖，王玉明，薛 勇

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003；2.淮海工學院海洋學院，江蘇連云港222005）

谷氨酰胺轉氨酶對堿溶酸沉法提取南極磷蝦(EUPHAUSIA SUPERBA)蛋白質得率的影響

王靈昭1，2，薛長湖1，*，王玉明1，薛 勇1

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003；2.淮海工學院海洋學院，江蘇連云港222005）

通過堿溶酸沉法提取了南極磷蝦蛋白質，研究了谷氨酰胺轉氨酶的應用對蛋白質得率的影響。結果表明：堿溶酸沉法能夠較好地回收南極磷蝦蛋白質；在酸沉過程中，合理添加谷氨酰胺轉氨酶能夠提高蛋白質得率約5%。

南極磷蝦，蛋白質得率，堿溶酸沉法，谷氨酰胺轉氨酶

南極磷蝦（Euphausia superba）總生物量和總后期幼體的年產量分別是1.17～3.79億t和3.42～5.36億t[1]。根據2004年FAO的報道，2000年以來全球包括野生和養殖所有漁業的年捕獲量約為1.3億t[2]。因此，作為人類潛在的食品，南極磷蝦的資源量非常巨大。南極磷蝦含有水分77.9%～83.1%，脂質0.4%～3.6%，蛋白質11.9%～15.4%，殼聚糖2%[3]。因此，南極磷蝦的開發，尤其是其作為食品蛋白源的開發應被充分重視。堿溶酸沉法已被成功地用于植物蛋白，尤其是大豆蛋白的工業化生產。近年來，堿溶酸沉法被應用于魚蛋白的提取，和魚糜加工相比，其顯著提高了蛋白質的回收率[4－5]。因此，堿溶酸沉法提取南極磷蝦蛋白質具有易工業化的可能，值得進行研究。但是，南極磷蝦的消化道內含有大量的自溶酶，包括蛋白酶、羧肽酶、核酶和磷脂酶[6]，其蛋白自溶酶可以快速、完全地降解各種蛋白質[7]。南極磷蝦死后，由于體內酶抑制系統活性減弱，磷蝦酶極易使其自溶。除強大的蛋白自溶酶外，南極磷蝦還含有相對較高的水溶性蛋白[8]。這些因素對堿溶酸沉法提取南極磷蝦蛋白都是不利的。本文研究了堿溶酸沉法提取南極磷蝦蛋白質的得率，以及提取過程中谷氨酰胺轉氨酶的應用對得率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

體長約2.5～5cm的整只冷凍南極磷蝦蝦磚（Euphausia superba） 由日本水產株氏會社提供，在－30℃低溫冷庫中經錘式粉碎機冷凍粉碎后置－30℃低溫下貯藏備用；谷氨酰胺轉氨酶（酶活力100U/g） 泰州一鳴精細化工有限公司；其它生化試劑 均為分析純。

YTPCZ密封錘式粉碎機 鶴壁市英泰電子電器有限公司；FE20K梅特勒－托利多酸度計 瑞士梅特勒－托利多集團；T18 ULTRA－TURRAX高速分散機 德國IKA集團；LCB200低溫循環槽 上海滬粵明科學儀器有限公司；TDL－5－A低速大容量多管離心機 上海安亭科學儀器廠；ALPHA 1－4 LD plus冷凍干燥機 德國CHRIST集團。

1.2 實驗方法

1.2.1 南極磷蝦蛋白質的提取 冷凍粉碎磷蝦和蒸餾水按1/6（M/V，g/mL）的比例攪拌混合，混合物用Ultra－Turrax勻漿機勻漿（4檔，1min），調節pH11.5，攪拌浸提（4℃，30min），將堿提液離心（4500r/min，10min）得液相A和沉淀A。沉淀A加入其質量3倍體積的蒸餾水，調節pH11.5，攪拌浸提（4℃，30min），將堿提液離心（4500r/min，10min）得液相B。合并液相A和液相B，得液相C。調節液相C至pH4.6，4℃靜置反應30min，離心（4500r/min，10min），得液相D和沉淀D，沉淀D即為南極磷蝦蛋白質。測定液相D的體積和蛋白質含量。將沉淀D完全轉移至平面皿，真空冷凍干燥之后測定：質量，蛋白質含量，水分含量。計算南極磷蝦蛋白質得率Y1（式1）和液相D中蛋白質比率Y2（式2）。

1.2.2 谷氨酰胺轉氨酶的應用對蛋白質得率的影響 根據1.2.1的方法得液相C。對液相C進行酸沉，在酸沉的過程中按以下三種途徑加入谷氨酰胺轉氨酶（酶活力100U/g），考察谷氨酰胺轉氨酶對蛋白質得率的影響。

途徑一：取一定體積的液相C，調節至pH4.6，分別加入不同量的谷氨酰胺轉氨酶（0.1、0.3、0.5g/100mL），恒溫搖床水?。?5℃，1h），離心（4500r/min，10min），得液相D和沉淀D。

途徑二：取一定體積的液相C，調節pH6.0，分別加入不同量的谷氨酰胺轉氨酶（0.1、0.3、0.5g/100mL），恒溫搖床水浴（35℃，1h），用2mol/L HCl調節酸沉至pH4.6，離心（4500r/min，10min），得液相D和沉淀D。

途徑三：取一定體積的液相C，調節pH6.0，分別加入不同量的谷氨酰胺轉氨酶（0.1、0.3、0.5g/100mL），恒溫搖床水?。?5℃，1h），離心（4500r/min，10min），得液相D和沉淀D。

分別測定液相D的體積和蛋白質含量；分別將沉淀D完全轉移至平面皿，真空冷凍干燥之后測定：質量，蛋白質含量，水分含量。分別計算南極磷蝦蛋白質得率Y1（式1）和液相D中蛋白質比率Y2（式2）。

1.2.3 化學分析和數據分析 蛋白質含量的測定執行凱氏定氮法；水分含量的測定執行105℃恒重法。采用SPSS10.0統計軟件進行數據分析，結果以±s表示。

2 結果與討論

2.1 南極磷蝦蛋白質的提取

由表1可知，南極磷蝦蛋白質得率為57.68%。魚糜加工是回收魚肉蛋白的傳統方式，但是通過傳統的魚糜加工工藝，100kg原料魚大約能夠得到19.5kg魚糜[9]，大量的魚肉蛋白隨著漂洗工序流失，其蛋白質回收率低。此外，除強大的蛋白自溶酶外，南極磷蝦還含有相對較高的水溶性蛋白[8]。因此，目前魚糜加工工藝沒有成功應用于南極磷蝦蛋白質的回收。文獻[10]報道，采用等電點沉淀法從整只南極磷蝦中提取磷蝦蛋白濃縮物時蛋白質得率為原料干基的45%～50%。因此，57.68%的得率說明本研究的堿溶酸沉法能夠較好地回收南極磷蝦蛋白質。文獻[10]和本研究中蛋白質得率的差異在于提取工藝和計算方法的不同。

表1 南極磷蝦蛋白質提取結果（±s，n=3）Table 1 Antarctic krill protein extraction results（±s，n=3）

表1 南極磷蝦蛋白質提取結果（±s，n=3）Table 1 Antarctic krill protein extraction results（±s，n=3）

項目 Y1（%） Y2（%）指標值 57.68±0.82 38.44±0.38

由表1可知，液相D中蛋白質比率為38.44%，即酸沉時原料中38.44%的蛋白質不能夠被沉淀回收。目前的研究表明，南極磷蝦蛋白酶主要包括8種蛋白自溶酶：TLⅠ、TLⅡ、TLⅢ、CL、CPAⅠ和CPAⅡ。CPBⅠ和CPBⅡ、TLⅠ具有外切酶和內切酶的活性，而TLⅡ和Ⅲ只具有內切酶活性[11]，CPA和CPB具有外切酶活性[12]。由于南極大磷蝦體內的內肽酶和外肽酶的比例適宜，因此，可以快速、完全地降解各種蛋白質[7]。此外，磷蝦自溶酶的一個顯著特性是在0℃以下仍然能夠水解蛋白[13]。本研究采用的原料是冷凍南極磷蝦死體，因此由于南極磷蝦蛋白自溶酶在其貯運過程中的自溶作用和含有較高的水溶性蛋白，使得酸沉過程中部分蛋白質的分子量較小或等電點偏離pH4.6而在離心的過程中不足以被沉淀回收。

2.2 谷氨酰胺轉氨酶的應用對蛋白質得率的影響

谷氨酰胺轉氨酶（transglutaminase，TGase）是一種催化酰基轉移反應的轉移酶，它能使蛋白質與蛋白質、蛋白質與氨基酸之間發生交聯反應，形成ε－（γ－谷氨酰）賴氨酸鍵，從而改變蛋白質的結構和功能性質[14]。因此，根據2.1的分析，推測在酸沉的過程中添加TGase可以使得液相D中不能被沉淀回收的部分小分子蛋白質和肽由于受TGase作用，分子之間發生交聯反應，分子量變大，功能性質改變，從而在pH4.6酸沉反應之后可以被離心回收，提高蛋白質得率。根據產品說明，本研究采用的TGase對蛋白質作用的適宜條件為pH6.0，35℃，1h；根據前期研究，南極磷蝦蛋白最適酸沉pH為4.6（數據未列出）。因此，在酸沉的過程中，本研究設計了三條不同的途徑（參見1.2.2）添加TGase，考察其對蛋白質得率的影響，實驗結果分別參見表2、表3和表4。

由表2可知，隨著TGase添加量的增加，和空白相比，Y2有不同程度的減小，Y1有不同程度的增加，說明途徑一的方法能夠提高蛋白質得率。當TGase添加量為0.5g/100mL時，Y2約減小5%，由于TGase的主成分也是蛋白質，不排除此時液相D中溶有少許來自TGase的蛋白質，因此蛋白質的得率至少提高5%；當TGase添加量為0.5g/100mL時，Y1約增加10%，說明蛋白質得率的提高是因為TGase的作用，并且由于部分TGase參與了反應，使得其也被沉淀回收。雖然隨著TGase添加量的增加，蛋白質得率增加，但是沉淀蛋白質中引入TGase的量也增加，此外TGase添加量會使得經濟成本增加，因此認為TGase添加量不宜過大。

表2 途徑一中谷氨酰胺轉氨酶的應用對蛋白質得率的影響（±s，n=3）Table 2 Effect of application of transglutaminase on protein yield in method 1（±s，n=3）

表2 途徑一中谷氨酰胺轉氨酶的應用對蛋白質得率的影響（±s，n=3）Table 2 Effect of application of transglutaminase on protein yield in method 1（±s，n=3）

添加量（g/100mL） Y1（%） Y2（%）空白 57.68±0.82 38.44±0.38 0.5 68.18±0.92 33.38±0.26 0.3 62.74±0.79 34.60±0.28 0.1 57.83±0.66 35.82±0.34

表3 途徑二中谷氨酰胺轉氨酶的應用對蛋白質得率的影響（±s，n=3）Table 3 Effect of application of transglutaminase on protein yield in method 2（±s，n=3）

表3 途徑二中谷氨酰胺轉氨酶的應用對蛋白質得率的影響（±s，n=3）Table 3 Effect of application of transglutaminase on protein yield in method 2（±s，n=3）

添加量（g/100mL） Y1（%） Y2（%）空白 57.68±0.82 38.44±0.38 0.5 61.64±0.86 41.48±0.41 0.3 61.64±0.78 41.48±0.36 0.1 51.52±0.74 45.22±0.32

由表3可知，隨著TGase添加量的增加，和空白相比，Y2和Y1均有不同程度的增加。因為Y2的增加，所以認為途徑二的方法在提高蛋白質得率方面不可行。Y1的增加，推測其原因是在酸沉的過程中部分TGase被沉淀回收。

表4 途徑三中谷氨酰胺轉氨酶的應用對蛋白質得率的影響（±s，n=3）Table 4 Effect of application of transglutaminase on protein yield in method 3（±s，n=3）

表4 途徑三中谷氨酰胺轉氨酶的應用對蛋白質得率的影響（±s，n=3）Table 4 Effect of application of transglutaminase on protein yield in method 3（±s，n=3）

添加量（g/100mL） Y1（%） Y2（%）空白 57.68±0.82 38.44±0.38 0.5 45.35±0.92 58.09±0.46 0.3 43.77±0.80 55.48±0.52 0.1 41.70±0.84 54.27±0.36

由表4可知，隨著TGase添加量的增加，和空白相比，Y2有不同程度的增加，Y1有不同程度的減少，說明途徑三的方法降低了蛋白質得率。Y2的增加是因為TGase的主成分也是蛋白質，液相D中溶有來自TGase的蛋白質。

綜合表2、表3和表4可知，在酸沉的過程中，根據途徑一的方法添加TGase，能夠使得蛋白質的得率約提高5%；TGase產品說明中的pH6.0不適宜用來提高南極磷蝦蛋白質得率。

3 結論

堿溶酸沉法能夠較好地回收南極磷蝦蛋白質；在酸沉的過程中，合理添加TGase能夠提高蛋白質得率約5%，原因在于酸沉的過程中添加TGase可以使得原來不能被沉淀回收的部分小分子蛋白質和肽由于受TGase作用，分子之間發生交聯反應，分子量變大，功能性質改變。酸沉過程中，添加TGase后的最適酸沉條件需要進一步研究。堿溶酸沉法回收的南極磷蝦蛋白質的營養價值、功能性質和產品開發值得進一步研究。

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Effect of transglutaminase on yield of proteins extracted from whole Antarctic krill（Euphausia superba）by alkaline solubilization and acid precipitation method

WANG Ling-zhao1，2，XUE Chang-hu1，*，WANG Yu-ming1，XUE Yong1
（1.College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2.School of Marine Science and Technology，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，China）

Alkaline solubilization and acid precipitation method was employed to extract proteins from whole Antarctic krill（Euphausia superba），and effect of transglutaminase on protein recovery yield was researched. Results indicated that the alkaline solubilization and acid precipitation method was good at recovering protein from whole Antarctic krill，and protein recovery yield was increased by approximate 5%，when transglutaminase was correctly applied during acid-induced protein precipitation.

Antarctic krill；protein yield；alkaline solubilization and acid precipitation method；transglutaminase

TS254.1

A

1002－0306（2012）03－0139－03

2011－02－14 *通訊聯系人

王靈昭（1976－），男，博士研究生，講師，研究方向：食品資源開發與利用。

國際科技合作項目（2010DFA31330）；國家863計劃項目（2011AA090801）。