枇杷花提取物抗氧化活性研究

閆永芳，孫 鈞，孟天真，葉興乾

（1.浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江杭州310029；2.浙江省農業廳經濟作物管理局，浙江杭州310020）

枇杷花提取物抗氧化活性研究

閆永芳1，孫 鈞2，孟天真1，葉興乾1

（1.浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江杭州310029；2.浙江省農業廳經濟作物管理局，浙江杭州310020）

采用DPPH、ABTS、FRAP和福林酚（F－C）四種方法測定枇杷花酚類化合物的抗氧化活性，比較最優條件下蒸餾水、甲醇、乙醇三種溶劑的提取效率。結果表明，DPPH、ABTS、F－C法所測抗氧化活性順序一致，即為水提物＞甲醇提取物＞乙醇提取物，但當量大小有所差異，其中F－C實驗結果最大；FRAP實驗中，甲醇提取物抗氧化活性略大于水提物，乙醇提取物活性最低。其原因可能是由于提取溶劑極性不同，反應機理不同，FRAP法基于單電子轉移原理。因此，枇杷花酚類物質在乙醇中的溶解性較差。

枇杷花，DPPH，ABTS，F－C，FRAP，抗氧化

枇杷花，為薔薇科枇杷屬植物枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）的花，既可作為飲品也可入藥，具有化痰止咳、和胃降氣的功效[1]。因枇杷花藥食功效顯著，近年來，有關枇杷花的深加工產品越來越受廣大消費者歡迎，因此有必要對枇杷花功能性成分做深層次的研究。食品中的酚類化合物作為一種具有生物活性的功能性成分，備受關注。大量流行病學研究表明，酚類化合物具有淬滅單線態氧和清除自由基的作用[2]，與一些疾病的預防有密切關系，如各種癌癥、心血管和神經性疾病以及衰老引起的相關疾病[3]。目前，受消費者喜愛的一些飲品，如紅酒和可可飲料都富含酚類抗氧化物[4－5]。其次，酚類物質還能賦予食品特殊的感官品質，如紅酒，它可以賦予紅酒一些特有的感官特性，如色澤、澀味等[6]。酚類物質還具有抗病毒、抗菌作用，顯著提高內皮功能[7]，此外，酚類物質是提高食品品質、延長保質期的功能性物質[8]。因此，評價消費食品的抗氧化能力意義重大。本實驗在以蒸餾水、甲醇和乙醇為最優萃取條件前提下，采用DPPH、ABTS、福林酚（F－C）和FRAP四種方法比較枇杷花提取物的抗氧化活性，為進一步研究枇杷花中酚類化合物組成提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

寧海白枇杷 2009年11月采集自浙江省寧波市寧海縣（東經121°25′、北緯29°17′），采集的鮮枇杷花置于樣品袋中6h內運回實驗室并進行及時處理，將采集樣品過篩，收集花瓣，置于60℃干燥箱內鼓風干燥過夜，磨粉，儲存備用；Fe3+－三吡啶三吖嗪（Tripyridyl－triazine，TPTZ）、ABTS[2，2’－Azinobis（3－ethylbenzothiazoline 6－sulphonate）]、6－羥基－2，5，7，8－四甲基色滿－2－羧酸（Trolox）、1，1－二苯基－2－苦基苯肼（1，1－Diphenyl－2－picryl－hydrazyl，DPPH）、福林酚試劑（Folin－Ciocalteu reagent）、沒食子酸（Gallic acid） 均購自Sigma公司；甲醇、乙醇、鹽酸等 均為分析級。

離心機KA－1000 上海安亭科學儀器廠；UV－2550紫外/可見分光光度計 日本SHIMADZU公司。

1.2 枇杷花有效成分的提取

分別采用水、甲醇、乙醇熱回流浸提枇杷花中有效成分。料液比1∶15，回流提取2次，每次1.5h，旋轉蒸發除去溶劑，經冷凍干燥分別得到三種溶劑抗氧化活性粗提物。分別配制一定濃度的樣品甲醇溶液備用。

1.3 抗氧化活性評價

1.3.1 DPPH自由基清除實驗 測定方法參考文獻[9]并略有改動。配制0.1mmol/L的DPPH試劑，取0.1mL提取液與3.9mLDPPH試劑混合，在暗處反應0.5h，隨后在515nm下測定吸光值。根據樣品吸光值的變化計算抑制率：

式中：A0為空白對照的吸光值，A1為樣品的吸光值。

以Trolox作為標樣制作標準曲線，結果以Trolox當量TE（Trolox equivalent）表示。

1.3.2 ABTS自由基清除實驗[10]取440μL 140mmol/L的過硫酸鉀溶液加入到25mL 7mmol/L的ABTS溶液中混合，避光反應12～16h。測定之前加入乙醇將ABTS溶液稀釋至吸光值為0.700±0.002（734nm下）。將3.9mL的ABTS溶液與0.1mL經稀釋的提取液混合、搖勻，在室溫下反應6min后，在734nm條件下測定其吸光值。抑制率計算方法及標準曲線的制作同1.3.1。

1.3.3 FRAP實驗 參考文獻[11]方法并略作改動。FRAP試劑的配制為0.1mol/L醋酸緩沖液（pH3.6）∶10mmol/L的TPTZ溶液（溶于40mmol/L鹽酸）∶20mmol/L三氯化鐵= 10∶1∶1。取3.9mL FRAP試劑與0.1mL的樣品混合反應10min后，于593nm下測定吸光值。空白對照為0.1mL提取溶劑。以Trolox作為標樣制作標準曲線，結果用Trolox當量TE（Trolox equivalent）表示。

1.3.4 福林酚法（F－C） 參考文獻[12]并略有改動。取枇杷花提取液0.25mL，加入到25mL具塞試管中，同時加入0.25mL F－C試劑，在暗室中反應3min。加入2mL濃度為5%的碳酸鈉溶液，加蒸餾水至15mL，在暗室中反應25min。并在750nm下測定吸光值。以沒食子酸作為標樣制作標準曲線，抗氧化活性用沒食子酸當量GAE（Gallic acid equivalent）表示。

1.4 數據處理

所有實驗重復三次，結果以平均值±SD標示。數據結果進行方差分析，顯著水平P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 清除DPPH·的能力

DPPH自由基清除實驗是常用的體外抗氧化活性評價方法之一。該方法對反應物有一定的選擇性，且達到穩定所需時間長。枇杷花的不同溶劑提取物對DPPH·的清除能力結果如表1所示。清除DPPH自由基能力的次序為VC＞水提物＞BHA＞VE＞甲醇提取物＞乙醇提取物，其中VC效果最好（0.065mg/mL）；水提物在該實驗中也表現出良好的效果，IC50值為0.105mg/mL，低于陽性對照BHA（0.126mg/mL）和VE（0.135mg/mL）；甲醇和乙醇提取效果較差，IC50值分別為0.165mg/mL和0.203mg/mL。

表1 枇杷花不同溶劑提取物清除DPPH·、ABTS+·能力比較Table 1 Comparison of scavenging DPPH·，ABTS+·capacities of extracts with different solvents

2.2 清除ABTS+·的能力

ABTS實驗結果如表1所示，ABTS實驗中各枇杷花提取物的抗氧化活性的強弱順序與DPPH實驗組結果類似，即VC＞水提物＞BHA＞VE＞甲醇提取物＞乙醇提取物，但IC50值略低。VC的抗氧化活性最強（0.074mg/mL），水提物IC50值為0.081mg/mL，低于陽性對照BHA（0.102mg/mL）和VE（0.140mg/mL）；甲醇提取物活性稍強于乙醇提取物，其IC50值分別達到0.146mg/mL和0.157mg/mL。由實驗結果可知，DPPH法與ABTS法所得實驗結果的總體趨勢非常相似。

2.3 FRAP實驗測定抗氧化能力

FRAP實驗結果如表2所示。由表2可以看出，FRAP測試體系中，不同溶劑提取物的抗氧化活性次序為甲醇提取物（49.61mgTE/g）＞水提物（48.76mgTE/g）＞乙醇提取物（23.99mgTE/g）。與其他實驗結果相比，FRAP甲醇提取物活性高于水提物，這與DPPH、ABTS和F－C的實驗結果略有不同。這可能是由于反應機理不同所致：FRAP法基于單電子轉移機理，而ABTS、DPPH、F－C則由單電子轉移和氫原子轉移共同發生作用[12]。由此進一步驗證，不同方法其抗氧化活性測定結果有很大差異，不能僅用單一方法評價抗氧化活性[13－14]。

2.4 F-C法測定抗氧化活性

F－C法是一種使用非常廣泛的總酚測定方法。參考文獻[12]，在此基礎之上經過略微改動，與其他方法結合測定枇杷花提取物的抗氧化活性。酚類物質可以參與到氧化還原反應中，與抗氧化能力有很大的相關性。由表2可以看出，F－C實驗中水提物約為甲醇提取物活性的2.4倍（GAE分別為137.90mgGAE/g和56.76mgGAE/g），是乙醇提取物活性的4.1倍（GAE為33.47mgGAE/g），其整個趨勢與DPPH、ABTS實驗結果非常相似。值得注意的是沒食子酸當量在33mgGAE/g和140mgGAE/g之間，測定結果高于其他實驗所得結果。原因可能是該方法并不僅限于酚類物質，很多非酚類物質，如抗壞血酸以及一些糖類化合物，同樣可以與F－C試劑反應[15]；其次，有報道沒食子酸作標準時其反應活性和吸收值較Trolox高[16]，這也可能致使F－C法實驗結果偏高。

3 結論

DPPH、ABTS和F－C實驗中，枇杷花的水、甲醇和乙醇三種溶劑提取物的抗氧化活性強弱順序基本一致，水提物＞甲醇提取物＞乙醇提取物，其中F－C實驗結果當量數值最大；FRAP實驗敏感性較差，TE值較低，且三種溶劑提取物的抗氧化活性強弱順序略有不同。通過四種抗氧化活性評價方法比較得出，枇杷花水提物和甲醇提取物的抗氧化活性要高于乙醇提取物。因此，可以推斷枇杷花中的酚類化合物在乙醇中溶解得較少。本實驗為枇杷花中酚類物質的進一步研究提供了理論依據。

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Antioxidant capacities of loquat flower extracts using different solvents

YAN Yong-fang1，SUN Jun2，MENG Tian-zhen1，YE Xing-qian1
（1.College of Biosystem Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China；2.Industrial Crop Bureau，Agriculture Department of Zhejiang Province，Hangzhou 310020，China）

DPPH，ABTS，FRAP and F-C methods were used to analyze the antioxidant capacity of loquat flowers extracts.The results showed that water extracts exhibited the highest antioxidant capacity，followed by methanol extracts and ethanol extracts in the three methods（DPPH，ABTS，F-C）.In the FRAP method the methanol extracts showed higher antioxidant capacity than the water extracts.That may be due to different extract solvents and different reaction mechanisms.In general，the ethanol extracts exhibited the lowest antioxidant capacity.

loquat flower；DPPH；ABTS；F-C；FRAP；antioxidant capacity

TS255.1

A

1002－0306（2012）01－0122－03

2010－12－20

閆永芳（1987－），女，碩士研究生，研究方向：食品工藝、食品安全及控制技術。

教育部創新工程重大項目培育資金項目（707034）；浙江省重大科技專項重點項目（2008C02005－2）；中央高校基本科研業務費專項資金資助。