偏釩酸鈉促進(jìn)大豆芽異黃酮類物質(zhì)黃豆苷元和染料木黃酮合成的研究

張 玲，丁淑玲，谷秀芳

（1.泰山醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)系，山東泰安271000；2.濟(jì)南千佛山醫(yī)院，山東濟(jì)南250014；3.東莞東華醫(yī)院，廣東東莞523220）

偏釩酸鈉促進(jìn)大豆芽異黃酮類物質(zhì)黃豆苷元和染料木黃酮合成的研究

張 玲1，丁淑玲2，谷秀芳3

（1.泰山醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)系，山東泰安271000；2.濟(jì)南千佛山醫(yī)院，山東濟(jì)南250014；3.東莞東華醫(yī)院，廣東東莞523220）

目的：分析比較偏釩酸鈉對大豆芽合成異黃酮類物質(zhì)－黃豆苷元和染料木黃酮的影響；方法：將大豆種子在不同濃度的偏釩酸鈉水溶液（0、200、400、600、800、1000、1200、1400、1600mg/L NaVO3）于28℃萌發(fā)6d，第6d收獲富釩大豆芽，洗凈烘干至恒重，用95%乙醇提取大豆芽中的異黃酮類物質(zhì)－黃豆苷元和染料木黃素，黃豆苷元和染料木黃素含量由高效液相色譜法測定；結(jié)果：分析測定結(jié)果表明，當(dāng)大豆種子在濃度為200～600mg/L偏釩酸鈉溶液中于28℃萌發(fā)6d，收獲的大豆芽中的異黃酮類物質(zhì)黃豆苷元和染料木黃酮的含量高于同等條件下其他濃度偏釩酸鈉萌發(fā)液中萌發(fā)的大豆芽；結(jié)論：綜合大豆芽的生長情況及大豆芽中異黃酮類物質(zhì)－黃豆苷元和染料木黃酮含量等因素，在本實(shí)驗(yàn)條件下，萌發(fā)富釩大豆芽的適宜偏釩酸鈉酸濃度為200～600mg/L，適宜的培育時間為96～120h，適宜溫度為28℃。

偏釩酸鈉，大豆芽，異黃酮，黃豆苷元，染料木黃酮

大豆異黃酮作為天然的植物雌激素在哺乳動物體內(nèi)具有多種生物學(xué)功能，如大豆富含植物異黃酮、黃豆苷元、染料木黃酮及大豆黃素等，能夠與哺乳動物體內(nèi)各系統(tǒng)、器官組織細(xì)胞表面的雌激素受體結(jié)合，發(fā)揮效應(yīng)[1]。大豆異黃酮的雌激素活性僅為天然雌激素的1/100～1/1000，在活體內(nèi)起到雌激素和抗雌激素的雙重調(diào)節(jié)作用，對女性有較好的保健作用，能夠減輕或改善女性更年期癥狀，減少乳腺癌發(fā)病率[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大豆異黃酮可降低發(fā)生心血管系統(tǒng)疾病的風(fēng)險[3]、阻止骨的重吸收[4]、抗氧化和降低血清膽固醇水平等[5]，染料木黃酮是酪氨酸蛋白激酶和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的潛在抑制劑，因此，大豆異黃酮的抗腫瘤作用突出地表現(xiàn)在一些對激素有依賴性的腫瘤上，如乳腺癌（雌激素依賴性腫瘤）等，大量的實(shí)驗(yàn)及臨床研究已證明此點(diǎn)。大豆經(jīng)發(fā)芽處理后其異黃酮含量顯著增加，而抗?fàn)I養(yǎng)因子含量顯著減少[6]。因此，大豆芽是更符合現(xiàn)代營養(yǎng)保健理念的的天然食品。釩是人和動物的必需微量營養(yǎng)元素[7]。釩能夠影響多種生物學(xué)反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)，鹵素過氧化物酶中含有釩，釩還是生物固氮酶的活性中心[8]。但迄今為止，有關(guān)釩對植物異黃酮類物質(zhì)合成影響的的研究還未見報道。本實(shí)驗(yàn)以不同濃度的偏釩酸鈉水溶液培育大豆芽，通過高效液相色譜方法測定大豆異黃酮—黃豆苷元和染料木黃酮含量變化，重點(diǎn)考察釩對萌發(fā)中的大豆芽合成黃豆苷元和染料木黃酮的影響，以期為新型大豆功能食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆種 超市購買的當(dāng)年收獲的大豆；染料木黃酮（NIC－111704）、黃豆苷元（NIC－100347）標(biāo)準(zhǔn)品 購自中國國家標(biāo)準(zhǔn)品公司；色譜純甲醇、乙腈 購自Fisher公司；實(shí)驗(yàn)用水 由超純水機(jī)制備（18MΩ，美國Milli－Q公司）；0.45μm硝酸纖維素濾膜 購自Sigma公司；無水乙醇 購自上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

Waters 2695高效液相色譜儀 四元泵、在線脫氣、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器；通風(fēng)櫥、恒溫生物培養(yǎng)箱、藥物粉碎機(jī)，KQ－600DB數(shù)控大型超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；梅特勒1/100000電子天平 瑞士，梅特勒－托利多集團(tuán)，ABS型；高速冷凍離心機(jī) 德國Beckman。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 富釩大豆芽的萌發(fā) 隨機(jī)挑選子粒飽滿的大豆用50℃熱水浸泡30min，將水分瀝干，然后用37℃自來水配制不同濃度的偏釩酸鈉水溶液浸泡過夜，瀝去浸泡液，將浸泡好的大豆移入撫育筐，每個濃度三份，于28℃生化培養(yǎng)箱中避光萌發(fā)，每天于9、13、18點(diǎn)分別噴灑對應(yīng)濃度的偏釩酸鈉水溶液三次，于第24、48、72、96、120h分別收獲200g左右的鮮豆芽，記錄豆芽鮮重，然后用自來水反復(fù)沖洗豆芽，再用蒸餾水反復(fù)沖洗，直到?jīng)_洗液中檢測不到無機(jī)釩為止。然后用遠(yuǎn)紅外電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱65℃烘干至恒重（前后兩次質(zhì)量差小于2mg），最后稱量干豆芽重量，并粉碎過100目篩。

1.2.2 異黃酮的提取條件 分別精密稱取65℃烘干至恒重并粉碎過100目篩的大豆粉和大豆芽粉2g，每種平行稱取三份，分別加入95%乙醇50mL，渦旋振蕩30s，37℃超聲提取20min，離心（12000r/min）20min，0.45μm硝酸纖維素濾膜過濾后儲存于4℃，取10μL上樣測定。

1.2.3 色譜條件 XTerra MS C183.5μm色譜柱（2.1× 150mm），流動相：乙腈∶0.1%冰乙酸（35∶65）梯度洗脫，流速：0.2mL/min，檢測波長：254nm，柱溫：25℃。1.2.4 對照品溶液的配制 精密稱取65℃干燥至恒重的染料木黃酮：5.20mg，黃豆苷元：5.20mg，用適量色譜純甲醇溶解后定容至10mL，作為對照品溶液。

1.2.5 檢測限的測定 將上述配制的對照品溶液系列稀釋，從最低濃度溶液開始上樣測定，當(dāng)信噪比大于3時所對應(yīng)的最低濃度，即為該方法的檢測限，本實(shí)驗(yàn)方法的檢測限為3.15ng。 1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將對照品溶液系列稀釋為：0.100000、0.050000、0.025000、0.012500、0.006250、0.003125mg/mL，上樣10μL，測定各組分的峰面積，以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，測得峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得各組分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Table 1 Linearing of standard compounds

1.2.7 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品，分別加入一定量的對照標(biāo)準(zhǔn)品，依照供試樣品異黃酮提取方法處理并測試，結(jié)果見表2。

表2 方法回收率Table 2 Recovery of the method

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的準(zhǔn)確性

加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見表2，從表2可看出，本實(shí)驗(yàn)中有關(guān)大豆異黃酮類物質(zhì)大豆苷元和染料木黃酮的提取方法及測定方法達(dá)到分析測試方法的要求，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.2 生長時間對豆芽中黃豆苷元和染料木黃酮含量的影響

從表3可看出，大豆經(jīng)適當(dāng)?shù)陌l(fā)芽處理后，隨著培育時間的延長，黃豆苷元和染料木黃酮的含量迅速增加，從異黃酮含量的角度考慮，培育大豆芽的適宜時間應(yīng)為96～120h。

表3 萌發(fā)時間對大豆芽黃豆苷元和染料木黃素含量的影響Table 3 The contents of daidzein，genistein in soybean sprouts harvested in different germinating period

2.3 偏釩酸鈉對黃豆苷元和染料木黃酮合成的影響

從表4可看出，隨著培養(yǎng)液中偏釩酸鈉濃度的增大，富釩大豆芽中黃豆苷元和染料木黃酮含量隨之增加，和同等條件下自來水中萌發(fā)的大豆芽相比，400mg/L NaVO3處理組的大豆芽異黃酮類物質(zhì)黃豆苷元和染料木黃酮分別增加9.61%和73.34%，有關(guān)偏釩酸鈉影響大豆芽合成異黃酮類物質(zhì)黃豆苷元和染料木黃酮的機(jī)理還需要進(jìn)一步探討，但本研究結(jié)果提示，偏釩酸鈉的參與或激活了黃豆苷元和染料木黃酮合成的有關(guān)酶類。

另外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示，大豆芽對偏釩酸鈉有很強(qiáng)的耐受力，有關(guān)大豆芽對釩的富集率和有機(jī)轉(zhuǎn)化率及其富釩大豆芽的藥理作用有待進(jìn)一步的研究。

表4 不同濃度偏釩酸鈉水溶液中萌發(fā)的大豆芽中黃豆苷元和染料木黃素含量Table 4 The contents of daidzein，genistein in soybean sprout which germinating in NaVO3solution with different concentrations

3 結(jié)論

偏釩酸鈉能夠在大豆萌芽過程中促進(jìn)異黃酮類物質(zhì)大豆苷元和染料木黃酮的合成，同時培育富釩大豆芽也為無機(jī)元素釩的生物有機(jī)化提供了新的途徑，富釩大豆芽有望成為新一代的營養(yǎng)保健食品。結(jié)合大豆芽的生長情況及異黃酮含量綜合考慮，培育富釩大豆芽的適宜偏釩酸鈉濃度為200～600mg/L。

[1]Coward L，Barnes NC，Setchell KDR，et al.Genistein，daidzein，and their β－glycoside conjugates：antitumor is of lavones in soybeanfoodsfromAmericanandAsiandiets[J].JAgricFoodChem，1993，41：1961－1967.

[2]Martin PM，Horwitz KB，Ryan DS，et al.Phytoestrogen interaction with estrogen receptors inhuman breast cancer cells[J]. Endocrinology，1978，103：1860－1867

[3]Anthony MS，Clarkson TB，Hughes CL Jr，et al.Soybean is of lavones improve cardiovascular risk factors without affecting the reproductive system of peripubertal rhesus monkeys[J].J Nutr，1996，126：43－50.

[4]Jayo MJ，Anthony MS，Register TC，et al.Dietary soy isoflavones and bone loss in ovariectomized monkeys[J].J Bone Miner Res，1996，11：S228.

[5]Dodge JA，Glasebrook AL，Magee DE，et al.Environmental estrogens：effects on cholesterol lowering and bone in ovariectomized rat[J].J Steroid Biochem Mol Biol，1996，59：155－161.

[6]Phommalth S，Jeong YS，Kim YH et al.Effects of light treatment on isoflavone content of germinated soybean seeds[J].J Agric Food Chem，2008，56：10123－101238.

[7]Thompson KH.Orvig C：“Vanadium in diabetes：100 years from Phase 0 to Phase I”[J].J Inorg Biochem，2006，100：1925－1935.

[8]Guo JY，Han CC，Liu YM.A contemporary treatment approach to both diabetes and depression by cordyceps sinensis，rich in vanadium[J].Journal of Evidence－based Complementary and Alternative Medicine，2010，7：387－389.

Study on the synthesis of isoflavone including daidzein and genistein in soybean sprouts enhanced by sodium metavanadate

ZHANG Ling1，DING Shu-ling2，GU Xiu-fang3
（1.Department of Biological Science，Taishan Medical University，Taian 271000，China；2.Qianfoshan Hospital，Jinan 250012，China；3.Donghua Hospital，Dongguan 523220，China）

Objective：To analyse and compare the effect of sodium metavanadate on the synthesis of isoflavones including daidzein and genistein in soybean sprouts.Method：Soybean seeds were germinated in sodium metavanadate solutions （NaVO3）with different concentrations（0，200，400，600，800，1000，1200，1400，1600mg/L NaVO3）for 6 days at 28℃.The V-enriched soybean sprouts were harvested on the sixth day，the isoflavones including daidzein and genistein were extracted with 95%alcohol，and the contents of daidzein and genistein were determined with HPLC.Result：Soybean seeds germinated in 200～600mg/L NaVO3solutions for 6 days at 28℃showed ahigher content of isoflavones including daidzein and genistein than those obtained in NaVO3solutions with other concentration in the same germination donditions.Conclusion：The application of NaVO3solutions at a concentration of 200～600mg/L and germination for 6 days at 28℃ may be suggested for the production of the V-enriched chickpea sprouts，when comprehensively considering the contents of daidzein and genistein in soybean sprout together with its growth conditions.

sodium metavanadate；soybean sprouts；isoflavone；daidzein；genistein

TS201.2

A

1002－0306（2012）01－0079－03

2010－10－08

張玲（1966－），女，博士，副教授，研究方向：中草藥與微量元素結(jié)合預(yù)防糖尿病。