大鼠針刺置高臺固定方法

王宇,寧友,2,王培育,3,楊永清

(1.上海中醫藥大學上海市針灸經絡研究所分子生物學(針灸)實驗室,上海 200030;2.復旦大學附屬華山醫院中西醫結合研究所,上海 200040;3.河南中醫學院,鄭州 450008)

大鼠是在針刺機理實驗中被經常使用的動物。常用的大鼠固定方法有捆綁固定、器械固定、手部抓取固定等[1]。目前國內外普遍采用的針刺大鼠固定方法為束縛固定法,包括狹小空間固定與捆綁固定。但是束縛固定會引起大鼠束縛應激效應,與針刺效應疊加,嚴重干擾了針刺效應的客觀分析。因此,如何在針刺時,選擇適宜的大鼠固定方法,盡量減少應激效應對針刺效應的干擾,是針灸研究中所面臨的關鍵問題之一。

為此,我們利用大鼠具有畏高的特性,設計了大鼠置高臺的固定方法。以大鼠1型糖尿病模型為實驗對象,觀察束縛固定與置高臺固定下針刺對糖尿病大鼠血糖的影響。結果表明,與束縛固定方法相比,置高臺固定法對大鼠糖尿病模型血糖影響效小,是一種適合的大鼠針刺固定方法。

1 材料與方法

1.1 動物分組

健康雄性SD大鼠,CL級,購自中國科學院上海實驗動物中心,體重(220±10)g,36只,根據計算機隨機數字分為6組,每組6只。正常組(Normal)采取普食,不做任何處理;1型糖尿病模型組(DM)采取普食,1型糖尿病模型制作;1型糖尿病模型-束縛固定組(DM-Binded)采取普食,1型糖尿病模型制作,每天束縛固定30 min;1型糖尿病模型-束縛固定-針刺組(DM-Bin-Acu)采取普食,1型糖尿病模型制作,每天束縛固定30 min,同時針刺干預;1型糖尿病模型-置高臺固定組(DM-Elevated)采取普食,1型糖尿病模型制作,每天置高臺固定30 min;1型糖尿病模型-置高臺固定-針刺組(DM-Ele-Acu)采取普食,1型糖尿病模型制作,每天置高臺固定30 min,同時針刺干預。

1.2 儀器設備、材料與試劑

0.30 mm×15 mm針灸針(蘇州醫療用品廠有限公司出品的華佗牌無菌針灸針);羅氏 ACCU-CHEK Advantage血糖儀(羅氏診斷產品上海有限公司)。

鏈脲佐霉素(Streptozotocin,STZ,A.R.,Sigma)、檸檬酸(Citric acid monohydrate,A.R.,上?；瘜W試劑有限公司)、檸檬酸三鈉(Trisodium citrate dehydrate,A.R.,上?；瘜W試劑有限公司)、羅氏ACCU-CHEK AdvantageⅡ血糖試紙(羅氏診斷產品上海有限公司)。

1.3 大鼠1型糖尿病模型造模方法

大鼠1型糖尿病模型造模方法[2,3],SD大鼠被置于模擬晝夜變化(12 h白天,12 h黑夜)的清潔室內,溫度 20℃～23℃,濕度為 50%,所有動物造模前一天禁食過夜8 h。將STZ溶解在0.1 mol/L,檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液中(pH 4.2),配制成 1%STZ溶液,其中檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液是由0.1 mol/L檸檬酸三鈉母液和0.1 mol/L檸檬酸母液按1:1.32體積配制。按照 60 mg/kg劑量,一次性腹腔注射 STZ溶液,誘導糖尿病大鼠模型。

1.4 大鼠置高臺固定方法

將大鼠放置于木制高臺踏板(6 cm×12 cm)上,距地面50 cm(見圖1、2),每天1次,每次30 min。

圖1 大鼠針刺置高臺固定照片

圖2 木制高臺設計側面圖(左)與俯視圖(右)

1.5 大鼠束縛固定方法

大鼠腹部向下,四肢用醫用膠布粘縛于木板上,胸部用 1 cm寬皮帶固定,防止逃脫。每日 1次,每次30 min。

1.6 針刺方法

取肝俞、脾俞、腎俞[4]。肝俞位于第 9胸椎下旁開5 mm之兩旁肋間;脾俞位于第12胸椎下旁開5 mm之兩旁肋間;腎俞位于第2腰椎下旁開5 mm之兩旁肋間[5]。針刺方法采用直刺 6 mm,行平補平瀉,每 5 min行針1次(以200次/min捻轉速度,左右捻針20次為行針1次),留針20 min。隔日針刺1次,共4次。

1.7 大鼠血糖檢測方法

采用尾靜脈采血法,用鋒利刀片在尾靜脈上切開小口,取少量血液,用羅氏ACCU-CHEK Advantage血糖儀測定血糖濃度并記錄。測定時間安排在STZ注射前第8、1天和STZ注射后第1、2、3、5、7、9、11、13、15天,共11次,測定的時間安排在下午進行,兩側尾靜脈可交替切割,切割后用棉球壓迫止血。

1.8 統計學方法

本實驗采用血糖濃度參數評價1型糖尿病模型。多組比較用單因素方差(One-Way ANOVA)分析,組間析因分析用LSD檢驗,檢驗水準=0.05。兩組比較用獨立樣本t檢驗,檢驗水準=0.05。

束縛固定與置高臺固定下,針刺對DM大鼠血糖的平均影響率分析方法為非針刺組血糖均值(GLU1)與針刺組血糖均值(GLU2)的差值(GLUΔ)除以DM組血糖均值(GLU0),即為針刺對血糖的平均影響率(I),計算公式為 I=(GLU1-GLU2)/GLU0×100%。

2 結果

圖3-A可見,正常大鼠血糖值穩定。糖尿病模型組大鼠自造模第1天起,血糖水平逐漸增高,與正常大鼠比較,自造模第1天至第15天內,具有顯著統計學差異(P=0.000)。糖尿病模型-束縛組血糖與糖尿病模型組比較,存在明顯統計學差異(P＜0.05)。表明束縛固定可明顯降低糖尿病模型的血糖水平。糖尿病模型-置高臺組血糖與糖尿病模型組比較無統計學差異(P＞0.05)。表明置高臺雖然可以引起糖尿病模型大鼠血糖水平的變化,但無統計學意義。

圖3-B可見,與模型組比較,置高臺針刺可明顯降低糖尿病模型大鼠血糖水平(P＜0.05)。與糖尿病模型-置高臺組比較,置高臺針刺同樣可明顯降低糖尿病模型大鼠血糖水平(P＜0.05)。表明去除置高臺的本底效應,針刺依然對糖尿病大鼠血糖具有明顯下調作用,針刺的效應得到明顯體現。

圖3-C可見,束縛固定可明顯降低糖尿病模型的血糖水平(P＜0.05)。糖尿病模型-束縛-針刺組血糖與糖尿病模型組比較,也存在明顯統計學差異(P＜0.05),但與糖尿病模型-束縛組比較無明顯統計學差異(P＞0.05)。表明束縛應激效應顯著,在此效應基礎止,針刺本身的效應難以體現。

圖3-D可見,與糖尿病模型組相比,雖然束縛-針刺與置高臺-針刺均可明顯下調血糖水平(P＜0.05),但糖尿病模型-束縛-針刺組與糖尿病模型-置高臺-針刺組相比,兩組血糖水平差異不明顯(P＞0.05)。

圖3 束縛固定與置高臺固定下針刺對糖尿病大鼠血糖的影響

在束縛固定與置高臺固定下,針刺對糖尿病大鼠血糖的平均影響率分析,如圖 4所示,糖尿病模型-束縛-針刺組對糖尿病模型的血糖平均影響率為 12%(1%～15%),在造模第1天最大,第2天最小;而糖尿病模型-置高臺-針刺組對糖尿病模型的血糖平均影響率為 52%(39%～74%),在造模第 1～3天較大。兩者對大鼠血糖的平均影響率差異顯著(P＜0.05)。進一步顯示在不同固定條件下,針刺對糖尿病模型大鼠血糖的影響效果不同,置高臺情況下,針刺對糖尿病模型大鼠血糖的影響效應得到明顯體現。

3 討論

圖4 束縛固定與置高臺固定下,針刺對糖尿病大鼠血糖平均影響率的比較

應激是指機體內在的動態平衡狀態被打破后所出現的全身性非特異性適應反應過程。應激反應以機體受到內外環境刺激后產生下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸及交感腎上腺髓質活性增強為特征[6]。應激會干擾機體已有的平衡,引起機體的反饋與負反饋效應,產生損傷或保護作用,影響生理與病理反應。針刺效應是機體的自我調控的結果,因此在應激背景下進行針灸效應研究,必然導致應激效應與針刺效應的疊加,將會干擾對針灸效應的研究。目前在針刺機理實驗中普遍采用的大鼠針刺固定方法為束縛固定法。但是束縛固定會引起大鼠束縛應激效應。我們利用大鼠具有畏高的特性,設計了大鼠針刺置高臺的固定方法,以盡量減少應激效應對針刺效應的干擾。

本文結果顯示,糖尿病模型-束縛固定、糖尿病模型-束縛-針刺均能明顯降低糖尿病模型的血糖水平,兩者之間無明顯統計學差異,表明束縛應激效應顯著,在此效應基礎止,針刺本身的效應難以體現。糖尿病模型-置高臺組血糖與糖尿病模型組比較無統計學差異。與糖尿病模型組和糖尿病模型-置高臺組相比較,糖尿病模型-置高臺-針刺均可明顯降低糖尿病模型大鼠血糖水平,表明去除置高臺的本底效應,針刺依然對糖尿病大鼠血糖具有明顯下調作用,針刺的效應得到明顯體現。盡管糖尿病模型-束縛-針刺組與糖尿病模型-置高臺-針刺組相比,兩組血糖水平差異不明顯,但在束縛固定與置高臺固定下,針刺對糖尿病大鼠血糖的影響率分析結果顯示,糖尿病模型-束縛-針刺組對糖尿病模型的血糖平均影響率為 12%,而糖尿病模型-置高臺-針刺組對糖尿病模型的血糖平均影響率為 52%,二者存在明顯統計學差異,進一步顯示置高臺情況下,針刺對糖尿病模型大鼠血糖的影響效應得到明顯體現。

有文獻報道將大鼠置于高臺可誘發急、慢性應激,引起血漿中皮質酮水平和海馬中乙酰膽堿升高[7]。本文數據顯示,置高臺雖然能引起糖尿病大鼠模型血糖水平的變化,但無統計學意義,說明置高臺固定對血糖的影響很有限。可能提示,大鼠針刺置高臺固定方法,更適用于非應激性疾病的研究。

因大鼠置高臺時自然體位處于趴臥位,因此該固定方法較適合于選取大鼠頭背部、四肢外側的穴位進行針刺。如需針刺大鼠腹側面以及四肢內側面的穴位,尚需在此基礎上探索更理想的大鼠固定方法。

參考文獻

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